非洲动物锥虫病的纳米抗体

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胶体金试纸条

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免疫层析法:滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用(基于层析作用的横流 （lateralflow）向另一端移动。
移动过程中被分析物与固定在膜上某一区域的binder(抗原或者抗体)结合而被固相化，无关物质则越过该区域而被分离，然后通过标记物显色来判定试验结果，以胶体金为标记物的实验称为胶体金免疫层析试验。

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Nb44/Nb42胶体金能有效检测到PBS中的TcoPYK蛋白，最低检测剂量为880ng/ml(Fig. 5b)。用PBS等比稀释检测抗原TcoPYK。
在检测线包埋的是链霉素-标记的Nb42B抗体，灵敏度会有所提高（右图）。

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将样品TcoPYK稀释在天然鼠血清中做检测灵敏度通过以下策略进行进一步的改进：
(i)  样品粘度，它会影响样品流动速度，从而影响Nbs和TcoPYK之间的接触时间;(ii) 血浆基质效应，它会对抗原检测产生负面影响.
配制一种试剂缓冲液同时降低样品的流动速度和血浆基质效应。
缓冲液体系包括1%甲基纤维素，（增加样品粘稠度），1%吐温-20。
从图5e可以看到，用这种缓冲液三倍稀释的加有TcoPYK蛋白的天然鼠血浆，最低检测浓度能达到14ng/ml。

最终的胶体金试纸条组合是Nb44-AuNPs作为检测抗体，链霉素标记的Nb42B包埋检测线捕获抗原
检测样品三倍稀释于含有甲基纤维素和吐温的缓冲液中，试纸条用于评价鼠和牛感染样本。

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Nb44-Nb44/Nb42 ELISA和Nb44/Nb42的胶体金试纸条用于检测鼠感染锥形虫:

用5000单位的TC13锥形虫腹腔注射C57BL6/C小鼠(n=9)，在感染后第3，7，11，15，19，23，27，31，35天取样，取100ul的血加入抗凝剂。
样品处理：
① 显微镜观察样本，取2ul血，用RPMI-1640稀释50-100倍，镜下观察。
剩余的血液1500g离心10min，收集血浆用于ELISA、LFA检测。
② ELISA，30ul血浆加60ul的PBS-T稀释。
③ LFA:20ul血浆加40ul的含1%甲基纤维素的PBS-T，加入样品垫上，20分钟后可看结果。

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TcoPYK ELISA法、TcoPYK LFA法和镜检法对刚果锥虫感染小鼠的比较：
腹腔注射9只C57BL/6小鼠，每只接种5000个刚果热锥虫。分别于感染后第3、7、11、15、19、23、27、31、35天对小鼠进行采血。在每个时间点，取血100μl置于抗凝管中。取2 μl血，进行100倍和50倍稀释，进行镜下观察。其余血液1500g离心10分钟。收集血浆，ELISA和LFA检测。ELISA法血浆30μl稀释于60μl PBS-T中，LFA法血浆20μl稀释于40μl PBS-T(含1%甲基纤维素(Sigma))中，置于样品垫上。将ELISA、LFA和镜检结果进行比较，通过科恩kappa系数(Cohen’s kappa coefficient)测定各试验间的可信度。

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治疗后监测
感染Tc13的小鼠分为三组，每组各6只，每组中的一只作为阴性对照，不接受感染，另外五只腹腔感染5000单位的Tc13，第一组不进行治疗，第二组和第三组分别在感染后第六天和第14天接受贝尼尔治疗(20g/Kg）。可以看到多数小鼠在治疗后24小时，血液中寄生虫被清除，在第 −1、4、7、10、13、 16、 19、22天进行采血，LFA/ELISA不能再检测到相关抗原。

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刚果锥虫病病原体为布氏锥虫，它广泛地侵犯野生动物与家畜。

其中有三个亚种对人能致病，即布氏冈比亚锥虫（T.b.gambiense）、布氏罗得西亚锥虫（T．b．rhodesiense）、布氏布氏锥虫（T.b.brucei）。

布氏锥虫系细胞外寄生原虫。其亚种形态均极为相似。

虫体中央有一个核，后端有一个动基体。鞭毛附着于动基体，沿虫体侧波状膜到达虫体前端后游离。

锥虫形态多变，外形为长纺锤状，有细长型（长20～40 μm，游离鞭毛长达6 μm）或粗短型（长15～25μm，宽3.5μm，游离鞭毛短于1 μm或鞭毛不游离）。

细长者多见于外周血液内，呈梭状；粗短者多见于组织内。

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其生活史分在采采蝇（teetee fly），属舌蝇属（Glossinae）和人体两个阶段。

当采采蝇吸吮患者或病畜（兽）血时，锥虫随血进入蝇体，在中肠分裂繁殖，穿透肠壁游至前胃进入食管，到涎腺形成上鞭毛体，最后形成有感染性的鞭毛体。此阶段约需12～30天，并使蝇终身（3个月）有传染性。

在人体内阶段，乃由有感染性采采蝇叮咬人体时，锥虫即随唾液进入，在局部分裂繁殖后进入血流，在虫血症高潮时以细长型为主，当人体产生免疫力后，则以粗短型较多见。

锥虫的三个亚种形态极为相似，过去主要依靠其对某些动物的致病力、生化特点（同工酶）、在蝇体内繁殖情况、临床特点以及流行地区来鉴别。近年来则用分子生物学技术来鉴定。

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在医疗保健领域，“快速诊断检测(RDTs)”的开发是一个有前途的应用方向。快速诊断试剂需要满足"ASSURED“原则：即那些有感染风险的人负担得起，敏感的，具体的，用户友好、快速、强大、无设备，并提供给需要的人。