single domain antibodies：methods and protocols

傲慢与偏见

基于cDNA分析，IgG1分出两型，其中IgG1a抗体铰链区为19个aa，IgG1b抗体铰链区为12个aa单峰驼血清中的IgG2部分包含两种类型，IgG2a铰链区含35个氨基酸，IgG2c铰链区含15个氨基酸，另外在大羊驼体内有铰链区为29个氨基酸的IgG2b。

IgG3抗体的铰链区含12个氨基酸。
重链抗体和传统抗体的占比，在旧世界骆驼体内约为50%，而新世界骆驼科体内约为30%。

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重链抗体的进化来源，通过比较不同种类驼类的胚系基因，建立相应的进化树，证明抗体是来自于传统抗体基因结构的改变，而非休眠基因复苏。
VH和VHH基因进行比较，有部分同源，在成熟的可变区基因中包含部分相同的D区基因，这部分同源基因在成熟抗体分子中均由参与抗原结合的重要氨基酸残基组成。

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重链抗体的抗原结合区：
重链抗体的抗原结合位点不同于传统抗体的VH-VL两个区域，只有重链可变区一个区域，即VHH。
当对VHH进行重组表达，可以产生了一个可溶性的单域抗体(sdAb)片段，是传统抗体抗原结合区的一半大小。
因此，被寄予众望，认为VHHs虽然缺失轻链可变区，但是保持可溶性和功能性。

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纳米抗体的序列适应性：
和传统抗体的VH相比，VHH有标志性的5个氨基酸序列的改变
Leu12Ser, Val42Phe/Tyr, Gly49Glu, Leu50Arg/Cys, Trp52Gly ，其中前四个位点为相对保守的点突变。
氨基酸残基的编号参考IMGT
Leu12Ser位点的突变是适应CH1区的缺失
亲脂性的Leu被小的亲水性Ser替代能增加纳米抗体在水溶性环境的溶解度。
VH的42，49，50，52位位于和VL区的临界面
从Fv中去除VL结构域会使VH结构域的疏水表面暴露在溶剂中，导致黏性和聚集。氨基酸从疏水突变为亲水，使得VHH即使缺失VL区，也能保持稳定性，并且增加了溶解度。

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Nb高变区有3个显著特征：
① CDR1区存在体细胞高频突变热点（28位和30位），导致CDR区向N端延长，这些高突变也是反映了一个抗体亲合力成熟的过程。
② CDR3较传统抗体的CDR2长，大约为18个氨基酸，而人抗CDR3区约为14个氨基酸，鼠抗CDR3区约为11个氨基酸。
③ 除了保守的链内二硫键外，VHH CDR3中的CYS还可以与CDR1或FR2中的CYS形成二硫键，从而稳定可变区的空间构象。

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所有的序列适应性改变都是为了扩展纳米抗体的抗原结合面，得到更为多样的抗原结合位点，代偿性弥补轻链的缺失。

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纳米抗体的二级结构包含九个β链（ABCC'-C -DEFG），四链β-折叠和五链β-折叠，形成两个反向平行的β-片层，Cys23和Cys94之间的保守二硫键连接。

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传统抗体的VH和纳米抗体VHH氨基酸序列进行对比，表明VHH在传统VH和VL相互作用的区域进行了重塑。
传统抗体在重链和轻链可变区位置含有大量的疏水残基，因为大量暴露而相互黏黏，而纳米抗体中的疏水残基被亲水残基替代，如Gly49Glu，Leu50Arg，增加其水溶性，减少聚合性。该界面附近的残基还旋转了它们的侧链，而不变形C-α backbone，从而增加了VHH表面的亲水性。

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通过对单峰驼胚系基因分析，VHH基因大约有40种，VH基因大约有50种。VHH和VH都存在于重链V基因簇里，和D基因/JH基因进行重排。分别组装形成传统抗体和重链抗体。
单峰驼VHH根据半胱氨酸的位置/CDR2长度能分为7个VHH亚家族，而羊驼的VHH因为额外的半胱氨酸比较少，因此不以额外的半胱氨酸作为VHH亚家族的区分标志。

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VH和VHH氨基酸序列高度一致，和人的VH3基因有80%高度的同源性。
另外，单峰驼发现少量的VH和人类的VH4高度一致。尽管这些基因中不包含VHH基因的标志性氨基酸，FR2区多余的半胱氨酸形成的区域内二硫键，但是V-D-J重排产生的产物或者是传统抗体或者重链抗体的重链。