single domain antibodies：methods and protocols

傲慢与偏见

传统抗体轻重链的随机组合增加了抗原结合位点的多样性。
重链抗体则完全依靠VHH基因的多样性，因此和VH基因相比较，VHH基因拥有高频的突变热点和DNA重组信号。
序列变异主要出现在抗体结合位点的附近或者内部，编码残基为抗原结合环结构的决定簇。
总之，纳米体的序列的多样化来自额外的二硫键，高频率的核苷酸插入/缺失、基因替换，以及大量体细胞点突变。

傲慢与偏见

追求成本低，可再生的抗体需求持续增长。抗体的高度组织性和模块化结构使其便于针对不同需求进行修饰和改造。
对抗体进行微调从而对其进行亲合力，稳定性，内在亲和力，和分子大小的改进。
全抗分子生产成本高，组织渗透性能差。
此外，对于一些应用，如放射免疫治疗或体内成像，全抗分子fc介导的细胞效应或半衰期过长，成为抗体使用的瓶颈。用基因工程技术构建能与抗原结合的小分子片段在治疗和诊断使用上有一定的优越性。
传统抗体分子与抗原结合的部位局限于其可变区，由VH和VL通过一个合成的linker进行连接。
然而， 单独的VH或者VL区疏水区域暴露在溶剂中，容易发生聚集变性。

傲慢与偏见

纳米抗体和单链抗体相比，除体积优势外，重组表达也更为有利。
纳米抗体能在大肠杆菌中可以进行可溶性表达和非聚集性，并且在酵母系统中，如酿酒酵母和毕赤酵母，可以获得更高水平的纳米抗体。
另外，在烟草植物中表达的纳米抗体可以占叶片可溶性总组分的1.6%，证明纳米抗体可以作为转基因植物，是一种非常经济可行的有效手段。

傲慢与偏见

纳米抗体，由于其只有单一区域的性质，展现出几种生物技术应用的优势。
The VHHs within these

libraries retain full functional diversity resulting in the isolation of
high-affinity antigen-binding Nanobodies after phage display.
However, a naïve VHH library or a synthetic library on any autonomous (human) VH might also be used to retrieve specific antigenbinders. Also, the higher stability compared to scFvs, with the feature
of reversible denaturation offers an additional asset to these
Nanobodies (37, 38). This regained functionality after chemical or
thermal denaturation is mainly attributed to an efficient refolding.
The adaptations at the former VL interface and the packing of
extended CDR3 loops against this interface contributes to the
domain stability. These adaptations also confer a high level of solubility to these sdAbs. Furthermore, the single domain nature and
the small gene fragment size (350–380 bp) of an sdAb facilitate subsequent molecular manipulation to engineer multivalent formats

傲慢与偏见

VHH分子小，组织通透性好，同时远低于肾小球滤过截止大小(65 KDa)，导致它们在血液中的半衰期很短，使得其在临床治疗中的使用受限。
Fc融合、PEG化、白蛋白融合等可延长半衰期。

傲慢与偏见

布鲁塞尔自由大学偶然在骆驼体内发现独特的重链抗体，正值众多研究人员奋力尝试从杂交瘤来源的抗体分子中克隆和表达有抗原结合活性的抗体分子片段之时。重链抗体的抗原结合可变区，即纳米抗体随之被证明与其他抗原结合抗体片段相比，具有多种生化和生物物理优势，被研究人员给予很高的期望。
现在，纳米抗体对研究、生物技术和医学产生了重大且日益增长的影响。

傲慢与偏见

在骆驼体内偶然发现功能性重链抗体的时候，许多实验室正在探索在微生物中表达fab(抗原结合片段)或scFvs(单链抗体），但是产量都不高。也在那个时期，发表了第一个抗体人源化的技术，是采用人的VH和VL骨架进行鼠VH和VL的CDR区移植。
其后，出现了噬菌体展示技术，用于建ScFv或者Fab库，筛选得到相应抗体。
只是早期并不容易筛选得到有功能的ScFv或者Fab片段，因为:
(1) VH和VL基因组克隆效率不高;
(2) 在免疫或者接种过程中经过亲合力成熟的原VH-VL基因对在建库过程中被打乱配对；
(3) 得到的scFv表达产量不高
(4) 筛选得到的Scfv在一些生理条件下不够稳定。

傲慢与偏见

在研究Nb生化和生物特性，结构的同时，研究者也尝试对VHH区进行表达。幸运的是，和ScFv，Fab不同，VHH在细菌中得以很好的表达，并且能正确折叠成稳定的单体。
世界各地的研究人员开始采用Nb技术并将其开发应用到超出预期的，更为广泛的领域中。

傲慢与偏见

所有的骆驼都具有组装重链抗体的胚系基因。IgH基因座中IGHGH基因在CH1和铰链区的内含子5‘端剪切位点发生点突变。因此，剪切位点不再被识别，从而造成CH1区基因随着内含子被切割掉。
羊驼和大羊驼都有两个IGHGH基因存在这种点突变 (IGHGH2a，IGHGH2b),
而单峰驼和双峰驼有三个IGHGH基因存在点突变(IGHGH2a, IGHGH2b ，IGHGH3)
编码重链抗体的恒定区。

傲慢与偏见

一项初步研究表明，在骆驼体内存在33个IGHVH基因，用于组合重链抗体，39个IGHV基因，组合传统抗体。
这个研究主要是基于单峰骆驼基因组DNA PCR后获得的克隆扩增子进行测序，可能存在偏差。
而对双峰驼的深度测序发现，有13个IGHV基因，4个IGHVH基因。
IGHVH基因和IGHV基因比较，42位，50位，52位出现点突变。
IGHV和IGHVH基因散布在基因簇中，与-IGHD-IGHJ进行基因重排，产生多样性的重链抗体。
值得注意的是，IGHV基因也可以被利用生成HCAbs。
而骆驼和美洲驼还有非常类似人IGHV4基因的IGHV基因，可以组成传统抗体或者重链抗体。