single domain antibodies：methods and protocols

傲慢与偏见

Since the first detection of an antigen-driven IgNAR response and isolation of antigen-specific VNAR , VNARs have been raised successfully against diverse targets for both therapeutic and diagnostic purposes and from multiple shark species (Table 1)

傲慢与偏见

纳米抗体的合成库或者半合成库能设计并且构建得到10^12库容量，典型的库采用天然的鲨鱼FR区作为骨架载体，通过CDR区，尤其是CDR3区点突变引入库的多样性，合成库的特性受到用于建库的骨架载体VNAR类型的影响，而单克隆的稳定性和抗体表位形状都受到影响。当合成VNAR文库设计得很好时，有时可以获得针对不同抗原的低纳米摩尔和皮摩尔结合体，而不需要亲和成熟。

傲慢与偏见

对于VNAR库，可以采取噬菌体展示，酵母展示，或者核糖体展示技术用于筛选VNARs。用ELISA，流式，NGS等方法进行针对靶抗原特异性结合的VNARs的筛选。
对于亲和力低的VNARs采用体外亲和力成熟的方法来提高亲和力。
比如致错PCR或者低亲和力RNA聚合酶的方法，可以提高亲和力10-20倍。
比如Fennell et al. 等发现好几个VNARs的61位核苷酸发生点突变 (SerΔArg)后能提高亲和力。

傲慢与偏见

和骆驼来源的VHH一样，VNAR体积小的特点有助于其在诊断和治疗上的应用，但是同时在有些应用领域有所限制。VNAR组织穿透力良好，通过生物膜渗透进行部位特异性药物输送，并在细胞内能靶向作用抗原。
半衰期短，系统清除快，非常合适作为诊断影像试剂。
但是作为治疗药物，需要延长血清半衰期。治疗性VNARs通过和半衰期延长的能识别多物种血清白蛋白的VNAR构建双价，三价的抗体而延长半衰期。
或者 将VNARs和IgG Fc段进行融合延长半衰期。添加了Fc段的VNAR还具有了Fc介导的效应功能，如抗体依赖的细胞杀伤，补体依赖的细胞杀伤等等。VNARs大约为75-80kDa，比传统抗体小一半左右，制备简单，并且有很好的组织穿透能力。

傲慢与偏见

四价VNAR结构域在N端和c端位置融合到一个IgG1 Fc片段上，因为没有VH-VL可变区的配对，VNARs重组构建相对容易。虽然没有明确的证据表明VNAR结构域在体内对人类具有内在的免疫原性，但对VNARs进行人源化或去免疫的改造还是很有必要。
Streltsov和他的同事报道了在I类免疫球蛋白家族和VNARs之间存在很大程度的结构相似性，因此用I类蛋白作为骨架用来设计，构建合成库。
以此为基础，他们得到亲和力为纳摩尔级别的抗趋化因子受体CXCR4的人源化抗体，改造成VNAR-Fc (AD-214) 结构，延长半衰期，目前在澳洲进行I期临床实验，作为孤儿药，用于特发性肺纤维化治疗。(ClinicalTrials.gov identifier: NCT04415671)

傲慢与偏见

VNAR以及由其重新改构的结构，包括solomer已经很容易使用现有的生物处理系统进行大规模生产。
VNAR的体积小，翻译后修饰如果不是很必需，可以很容易在大肠杆菌和毕赤酵母中表达。
而融合了IgG Fc融合VNAR，(如图2中的VNAR-Fc, QuadX和Quad-Y)需要一些翻译后的修饰，如在Fc区的糖基化修饰，可以在HEK293和CHO中进行表达。

傲慢与偏见

VNARs及其改构产物在原核以及真核表达系统中的产量。单价抗体能达到100-400mg/L。双价抗体能达到200 mg/L
三价抗体可以有100 mg/L
而IgG-Fc抗体产量能达到150 mg/L。
还有报道在CHO细胞中的瞬时转染，产量能达到460 mg/L。

傲慢与偏见

VNAR-Fc融合蛋白可以通过传统的protein-A亲和层析进行纯化，不带Fc融合蛋白的VNARs可以通过在N端或者C端添加如HIS，HA，C-MYC标签等进行融合表达，进而利用标签蛋白对VNARs进行鉴定和纯化。
VNAR的纯化能耐受如protein A等所需的低PH等纯化环境。

傲慢与偏见

第一篇发表的VNAR是针对恶性疟原虫顶端膜抗原1的抗体。
一个抗肿瘤坏死因子TNF -α的鲨鱼抗体，和阿达木单抗(Humira,修美乐)进行头对头研究在自发性多发性关节炎转基因小鼠模型中的作用。

傲慢与偏见

Ossianix的技术平台：

将靶向转铁蛋白受体TfR1的鲨鱼抗体VNAR-TXB4，与其他靶向性的抗体 (如靶向EGFRvIII、P2X3等靶点)融合，实现抗体分子的跨BBB运输，从而治疗各种CNS(中枢神经系统)疾病。