single domain antibodies：methods and protocols

傲慢与偏见

soloME是Elasmogen的专利技术。将VNAR转换为soloMER，保留了VNAR的独特特征，也使其得到人源化或去免疫化，去适应人类使用。soloMER可以提供与抗体相当的中和效力，但蛋白质的大小仅为其大小的9%。它们简单的分子结构在原核和真核系统中都能很好地表达。

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回顾抗体应用的发展历程，可以发现传统抗体的固有属性限制了其更为广泛的应用：
① 传统抗体尺寸大，难以穿越肿瘤组织以及人体屏障，限制了作为抗体药物的应用。
② 传统抗体结构复杂，稳定性差，导致其作为免疫试剂时，常常失效，限制了作为抗体试剂的应用领域。

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20世纪60年代发现，鲨鱼能够对抗原刺激产生保护性应答反应，说明鲨鱼体内存在适应性免疫系统。
鲨鱼体内的IgM最先被发现，具有两种不同沉降系数（19S和7S）。
然后IgW被发现，与高等脊椎动物的IgD同源性较高。
分泌型IgW存在两个类型，分别有3个和7个结构域。
1995年，Andrew等在护士鲨体内发现IgNAR。
IgNAR在适应性免疫中的作用由Dooley等证实，以鸡卵清溶菌酶(HEL）为抗原免疫护士鲨，经过3年的监测，证实在多次间隔免疫之后，鲨鱼产生快速强效的免疫应答。
2007年，在护士鲨中发现NAR-TCR的存在。

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所有VNARs都有两个典型的半胱氨酸，存在于FR1和FR3b区。此外，根据其非典型半胱氨酸残基及保守色氨酸残基的位置和数量主要分为三种亚型：
I型VNARs在CDR3区有两个半胱氨酸，分别和FR2和FR4的半胱氨酸形成二硫键。该型抗体只存在于护士鲨体内，可能为该物种所特有。
II型VNARs在CDR1区和CDR3区有2个非典型的半胱氨酸形成二硫键，并且在CDR3区可形成1个较长的指凸结构，易于识别抗原的隐藏表位。II型VNARs在所有的鲨鱼中都有发现。
III型VNARs和II型相似，在CDR1区半胱氨酸残基附近存在1个保守的色氨酸，III型通常出现在幼鲨体内，是保护新生鲨抵御常见病原体的广谱抗体，不过亲和力不高。

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和哺乳动物传统 VH 及驼源动物 VHH比，VNARs缺乏包含有 CDR2 区的 C′和 C″的 β 链。
尽管和VH折叠结构很相似，但是VNAR与哺乳动物传统抗体可变区之间氨基酸的同源性只有 25%–30%。
而和传统抗体的轻链或者TCR有更高的同源性。

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5A7：和鸡卵清溶菌酶 (HEL) 结合的鲨鱼抗体。Dooley 等利用免疫护士鲨构建噬菌体免疫文库，淘选得到的 5A7 ，亲和力为 20 nmol/L.通过 5A7 与 HEL 共结晶的方式，系统性研究了 VNARs 的晶体结构以及 5A7 与 HEL 的结合，结合生物信息学，发现有24个标志性残基，其中21个和VL，TCR Va区有高度同源性，这些保守序列方便利用抗体VL区进行VNARs的同源模建。
发现 5A7 中只有 CDR1 和 CDR3 区会与 HEL 接触，且 CDR3 区的 Arg100 与 Tyr101 会深入到 HEL的酶活性中心，从而抑制 HEL 的酶活性。
以 5A7为模型，利用核糖体展示技术以及易错 PCR 对VNAR 序列中各氨基酸的功能进行了系统性研究。通过反复突变以及淘选，获得 320 个含有突变氨基酸并保留抗体活性的序列，经测序及分析，发现其中 3 个位点氨基酸的突变 (A1D、 S61R 和G62R) 可以提高亲和力，最终结合这 3 种突变，使 VNAR 突变体的亲和常数达到 460 pmol/L，比野生型 5A7 提高了 20 倍。

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E06: 第一个报道的人源化的VNAR。

E06是从人血清白蛋白 (HSA) 免疫的白斑角鲨噬菌体展示文库中分离获得，E06 自身并不能用于疾病治疗，为了降低 E06的免疫原性，利用人种系V kappa轻链(DPK9)作为模板。结果发现，人源化 E06 的亲和力及特异性得到较好的保留。

该人源化的的VNAR和原生VNARs，现在被称为solomer™，利用树突细胞-T 细胞系统 (DC-T) 测试突变株的免疫原性，发现 BA11 等突变株几乎没有免疫原性。基于亲和力、免疫原性以及半衰期等数据，认为突变株BA11最具有临床应用价值。

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靶点：恶性疟原虫顶端膜抗原 1 (AMA1)是一种重要的蛋白抗原，含有 1 个保守的蛋白裂隙。
Nuttall 等利用半合成库，淘选得到 AMA1 特异性的 VNAR，命名为 12Y-2。随后对12Y-2进行一系列突变，并对 突变体与 AMA1 的晶体结构进行研究，结果显示， VNAR 的 CDR3 区能够深入到 AMA1 的疏水裂隙中。 因此有学者认为识别裂隙等隐藏抗原表位可能是单域抗体的基本特征。

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人肿瘤坏死因子 TNFα (rhTNFα) :① Camacho-Villegas等利用佛氏虎鲨 Heterodontus francisci 制备噬菌体免疫文库，经过 4 轮淘选分离获得针对rhTNFα 的 VNAR，并命名为 T43。通过细胞实验证实 T43 具有中和 rhTNFα 的能力。同时利用脂多糖诱导的内毒素休克小鼠模型证实 T43 能显著降低小鼠的死亡率。 T43 所表现出的良好的治疗效果以及组织渗透性等，使其有潜力成为免疫治疗药物。
② Obinna C.等用免疫库筛选到针对TNF-α的VNAR，将两株构建成多种形式的多价抗体，其中一种形式的抗体Quad-X™ 和商品化药物鼠抗修美乐进行头对头实验，在自发性多发性关节炎转基因小鼠模型中发挥同等效力。
除了以TNF-α作为靶点外，针对慢性炎症疾病，还以B细胞激活因子、转铁蛋白受体1、诱导共刺激配体(ICOSL)、和血管内皮生长因子(VEGF165)作为靶点制备VNARs。

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肿瘤学靶点：
VNAR也已被用于对抗多种常用的肿瘤学靶点，包括肿瘤胚胎酪氨酸激酶ROR1，极光激酶A，δ样配体4，上皮细胞粘附分子，人A型肝配蛋白受体EPHA2，人丝氨酸蛋白酶。