Construction and characterization of a replication-competent human adenovirus...

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Construction and characterization of a replication-competent human adenovirus type 3-based vector as a live-vaccine candidate and a viral delivery vector

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摘  要　
目的：在中国南方和周边亚洲地区，HAdV3频发流行。构建HAdV3感染性克隆，开发研制新疫苗。
方法：采用细菌同源重组的方法，得到一个稳定的HADV3基因组全长的感染性克隆质粒pBRADv，重组病毒经过双重PCR，WB，间接免疫荧光，电镜进行鉴定。另外，构建了一个含有报告基因eGFP的感染性克隆pBRAd⊿E3GFP用于评估腺病毒感染性克隆的蛋白表达能力。
结果：pBRADv具有感染性，能获得重组病毒，质粒中的Adv基因组无核苷酸突变。pBRAd⊿E3GFP通过肌肉注射，灌胃，鼻饲小鼠后，都能在血清中检测到EGFP抗体的存在，
结论：HADV3感染性克隆的构建为HADv3疫苗的研制，用于免疫和基因治疗的基因递送载体的构建，机制研究建立基础。

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背景资料
人腺病毒( human adenoviruses, HAdVs) 共有52种血清型，根据免疫学、生物化学等特性又可以分成6个亚型(A～F) 。
其中，B型分为两种亚型：
B1, 包括HAdV-3, -7, -16, -21, -50 ，SAdV-21;
B2, 包括HAdV-11, -14, -34 ，-35
腺病毒多和呼吸系统疾病有关在52种血清型当中， 1～8, 19, 21, 35血清型都与严重急性呼吸道疾病相关，其中7型腺病毒，和毒力相对较弱的3 型是致病性最高的两种。这两种同为B类的腺病毒所导致的下呼吸道感染占所有腺病毒导致感染的50%。
中国南方有几次HAdV-3的爆发，在这之前没有发生过HAdV-3的流行，所以群体免疫力比较差，中和抗体滴度较低，小规模的爆发就会导致很多人被感染，如果有安全有效低价的疫苗用于人口密集的易感人群，可以有效减少腺病毒的爆发流行。
目前常用的腺病毒载体主要是C类的HAdV-5或者HAdV-2型，野生株主要感染年轻人，感染后无症状或者轻微的呼吸方面症状。如果之前感染过该型腺病毒，体内已经产生免疫力，或者细胞表面缺乏CAR受体，整合素表达水平不高，都会影响到该型病毒作为病毒载体的使用。
A，C，D，E，F型腺病毒主要是识别细胞表面的CAR受体，与之结合后感染细胞，而B型腺病毒和这些病毒不一样，能直接感染如HAdV3作为新型病毒载体有其优越性，B型病毒除了通过CAR受体，还可以通过CDX, CD46, CD80 或者CD86，感染造血细胞和树突状细胞等。和HAdV-5型病毒载体相比较，HAdV-3型病毒载体可能会感染更多种类的细胞，包括一些CAR表达量较低的细胞，或者重要的基因治疗靶细胞。
备注：目前（2019年），HAdV3型病毒载体依旧没有得到广泛应用。

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实验材料
病毒株为 HAdV-3 广东1株，基因组序列信息见NCBI数据库GenBank: DQ099432.4
病毒在Hep-2细胞中放大培养。用改良后的蛋白酶K消化法提取病毒基因组。现在可以用试剂盒提取，比如：High Pure Viral Nucleic Acid Kit，Roche或者Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0，Takara。
菌株和质粒：E. coli BJ5183 （Stratagene）
pBluescript II SK (+)，PBR322 ，pEGFP-C2

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实验方法
重组质粒的构建主要运用定向克隆技术和同源重组技术。
利用RecA酶阳性的高效重组大肠杆菌（如BJ5183）同源重组系统进行HAdV-3感染性克隆的构建，这个宿主菌能够将含有同源序列的两段DNA分子， 一个是含有目的基因的穿梭载体，另一个是含有腺病毒基因组的腺病毒载体，通过菌株中含有的重组组件和两个DNA分子上的同源序列，将这两个DNA分子进行重组，获得新的质粒。

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1. 构建HAdV-3感染性克隆pBRADv：
常规分子克隆方法构建pBRALR质粒：
第一步：以AdLU1 / AdLD1为上下游引物，HAdV-3基因为模板，PCR扩增获得HAdV-3基因最左端AdL片段（1391 bp），通过EcoRI 和 HindIII双酶切插入BR322载体（基因序列GenBank: J01749.1）中。
AdLU1 (5’-GAATTCGCGATCGCTATCTATATAATATACCTTATAGATGG-3’)。
标注：红标序列为 EcoRI 酶切位点，绿标序列为AsiSI酶切位点，此处引物前若能加2-3个保护碱基会更方便PCR片段的有效酶切。
AdLD1 (5’-CTGCTGTGGATAAGCTTGAG-3’),
标注：红标序列为HindIII酶切位点。此处文章给的引物序列有误，非反向互补序列。如果按照上面序列交由公司合成时，合成出的是另一条引物，不可能和上游引物扩增出正确的PCR产物。
构建的质粒pBRALR电子克隆见附件

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第二步
以AdRU / AdRD为上下游引物，HAdV-3基因为模板，PCR扩增获得HAdV-3基因最右端AdR片段（2025 bp），通过HindIII 和Sal I双酶切插入第一步构建的载体中。AdRU: (5’- AACAAAGCTTACACTATGCATAGTCATAGTATC -3’)。
标注：红标序列为HindIII酶切位点。
AdRD (5’-AGTCGACGCGATCGCTATCTATATAATATACCTTATAGATG-3’),
标注：红标序列为 Sal I 酶切位点，绿标序列为AsiSI酶切位点。

构建的质粒pBRADv电子克隆见附件

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HindIII酶单切质粒pBRALR，线性化后用小牛碱性磷酸酶去磷。纯化，取100ng线性化后的质粒，和100ng提取的腺病毒HAdV-3基因组DNA混匀，电转BJ5183细胞。在含有AMP抗性的培养皿上进行培养，挑取小菌落，提取重组后质粒进行鉴定。

重组质粒的鉴定主要运用双重PCR技术和酶切鉴定，部分测序（测两端序列，中间序列）的方法。

双重PCR进行鉴定

利用载体上的序列和HAdV-3基因组上的序列对新构建的重组质粒进行PCR扩增鉴定。从50个随机挑取的小菌落中得到20个阳性克隆。

第一对引物（扩增产物长2646bp）：

GRS2624F： (5’-CCCCGAAAAGTGCCACCT-3’) ，pBR322 载体上的序列

T-X-3233.W1R (5’-GATACACAAGATAAAGCAGC-3’)，是HAdV-3基因组上的序列，此处文章给的引物序列有误，非反向互补序列。

第二对引物（扩增产物长2040bp）：

Ad33588F(5_-TCCTCACATCGTGGTAACTGG-3_)，是HAdV-3基因组上的序列，

GRS2622R(5_-TCTTCTTTATCATGCAACTC-3_)，是pBR322 载体上的序列，此处文章给的引物序列有误，非反向互补序列。

双重PCR鉴定后的质粒转化DH-5a，Qiagen质粒提取试剂盒提取质粒。

用AsiSI酶切质粒pBRAdV, 能得到线性化的HAdV-3 基因组，转染HEp-2细胞 ，每天观察有无细胞病变，转染后96小时，收获细胞，反复冻融三次，感染HEp-2细胞，96小时后，收集新的一代病毒。

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2. 构建pBRAd⊿E3GFP质粒：

常规分子克隆方法构建pSKE3LR质粒：

第一步：以AdE3LF / AdE3LR为上下游引物，HAdV-3基因为模板，PCR扩增获得HAdV-3基因片段E3L（973bp），通过Kpn I 和 Cla I双酶切插入pBluescript II SK(+)载体中。

AdE3LF (5’- GCGGGTACCAGGACTACTCCACCCG -3’)。

标注：红标序列为 Kpn I酶切位点。

AdE3LR (5’-TGAATCGATGGTAGTCCGTAGGAGGGTC-3’),

标注：红标序列为 Cla I 酶切位点。

第二步：以AdE3RF/ AdE3RR为上下游引物，HAdV-3基因为模板，PCR扩增获得HAdV-3基因片段E3R（1020bp），通过Spe I和Not I双酶切插入第一步构建的载体中。

AdE3RF ：5_TCGACTAGTATACGAGCTCGGTCC3)

标注：红标序列为SpeI酶切位点。

AdE3RR：(5_ AATGCGGCCGCAGTGGCATCAAAGTA 3)

标注：红标序列为Not I酶切位点。

最终构建的质粒电子序列见附件：pSKE3LR。

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常规分子克隆方法构建pSKE3LCMV-Egfp-SV40R质粒：

以CGSF / CGSR为上下游引物，pEGFP C2为模板，PCR扩增获得CMV-Egfp-SV40基因片段（1637bp），通过Cla I和Spe I双酶切插入pSKE3LR载体中。

CGSF(5_ GGTATCGATAGTTATTAATAGTAATCAATTAC-3’)

标注：红标序列为 ClaI 酶切位点。

CGSR(5_AATACTAGTGCAGTGAAAAAAATGC-3’)

标注：红标序列为 SpeI酶切位点。

构建的pSKE3LCMV-Egfp-SV40R质粒电子克隆序列见附件