An outbreak of acute respiratory disease caused by a virus associated RNA II ...

傲慢与偏见

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摘要大纲　
目的：HAdV-7是引起成人及儿童急性呼吸道疾病（ARD）的一个主要致病源，可导致致死性肺炎。本文报道一起由HAdV-7引起739名大学生ARD爆发事件，对分离的病毒进行基因组检测和分析，以更好了解这场大规模流行的根本原因。
方法：流行病学调查，样品血清学分型，基因组测序，病毒生长曲线，统计学分析。
结果：进化树和序列比对分析结果显示中国流行的HAdV-7毒株主要的六邻体和纤维蛋白基因高度保守，而VA RNA II末端区域有三个胸腺嘧啶的缺失。同时发现该区域的核苷酸缺失能够增强邻近基因L1 52/55K的mRNA表达，从而促进病毒快速生长。
结论：VA RNA II末端区域有三个胸腺嘧啶的缺失可能是本次HAdV-7感染后病情严重的一个重要原因，为更好了解 HAdV-7感染，VA RNA II基因可以用于监测。

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背景资料
人腺病毒（HAdVs）能引起急性呼吸系统疾病（ARD)，急性滤泡性结膜炎，出血性膀胱炎，胃肠炎，心肌炎，脑膜炎，严重者致死。
腺病毒感染在世界范围内爆发，是目前发热性疾病或者呼吸性疾病的主要病因。
腺病毒根据血清学，基因测序，生物学特性等可以分成7个亚型(A～G)，包括至少64种血清型。
HAdV7病毒感染能引起严重的呼吸性疾病，可伴随发热性咽炎和肺炎。HAdV7感染的严重程度和很多因素有关，比如病毒毒力，病毒传播环境，感染人群的身体状态，疾病发生的规模和程度。病毒基因组改变是HAdV-7毒力发生变化的主要原因，在一些新出现的流行株里有检测到SmaI突变和VA RNA基因的缺失，病毒毒力会有所增强。了解病毒基因组的变异情况会有助于预估和预防HAdV-7感染导致ARD情况。
一直以来，是通过核衣壳里六邻体蛋白和纤维蛋白基因来对检测腺病毒基因组有无变异，但是根据近来报道可见，这两部分基因高度保守，反而在VA RNA II基因可能发生缺失。
这篇文章中研究的2015年在武汉大规模流行的HAdV-7毒株，经过全基因组测序，发现在VA RNA II末端区域有三个胸腺嘧啶的缺失，可能是引起毒株毒力改变的主因。

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流行病学调查
2015 1.20-2.21期间，湖北武汉一大学发生ARD爆发，4113名学生中，828名出现症状，其中169名住院治疗，平均患病年龄为19岁。1月初，只有几个散发病例，2.6日学校有大型聚会，病毒开始传播，引起爆发，2.19日后实施一些控制措施，如隔离、消毒和用药，新的感染人数逐渐减少，没有再出现新的住院病例。

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样品采集，鉴定，血清分型
采集患者的鼻咽试子，提取病毒核苷酸， 用Seeplex1RV12 ACE and Seeplex 1 Pneumabacter detection kits (Seegene, Seoul, Korea)鉴定出病毒为腺病毒，排除了冠状病毒、副流感病毒，甲型流感病毒，乙型流感病毒，呼吸道合胞病毒A，百日咳博德特菌，肺炎军团菌、肺炎衣原体、肺炎链球菌、嗜血杆菌等的可能性。
确定为HAdV感染后，用实时荧光定量PCR对病毒进行血清学分型鉴定，结果显示为HAdV7型。

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病毒分离和基因组测序
4113名学生中，739名被实时定量PCR检测为HAdV-7阳性，住院病例中HAdV-7阳性率为76.9%，从HAdV-7阳性患者体内分离出20例病毒株，经在A549细胞放大培养后，PCR扩增六邻体，纤维蛋白，VA RNA基因，并进行测序，对比后证实20株病毒同源性100%，应该为同一个病毒株。BLASTn 比对发现六邻体蛋白和纤维蛋白的基因和HAdV-7 isolate CQ1198 (GenBank accession number JX625134)100%一致。而VA RNA基因 (GenBank accession number KU351170) 除了缺少两个胸腺嘧啶(T)外，其他一致，和CDC228 (KJ019884) 以及 XY1 (KJ019880) 比较，VA RNA基因缺少3个T.
选择 Z9/WH 分离株， 用附件中33对引物完成对基因组的全长测序。和CDC228比较，存在一些差异。
备注：Z9/WH strain (GenBank No. KX897164) 上传的HAdV7病毒基因组序列缺少5'端和3‘端的序列。

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用MEGA6.05 的多序列比对软件 MUSCLE对HAdV7的六邻体蛋白，纤维蛋白，VA RNA基因进行序列比对。所有的序列非常一致。所以后续研究就以Wuhan strain (KU351170)作为代表株，武汉流行株选择了Z9/WH strain (GenBank No. KX897164) 进行全长测序，和DNA聚合酶基因的分析。采用邻接法构建系统发生树。1000 bootstrap replicates were used to evaluate their topological accuracy（这一块内容尚未看懂）

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L1 52/55K mRNA的鉴定
提取流行株病毒RNA，以VA RNA II和E1基因作为参考基因，实时定量PCR鉴定L1 52/55K mRNA。
同时以 CDC228和XY1病毒株作为对照。
结果显示流行株Z9/WH的 L1 52/55K基因表达水平远高于CDC228和XY1株。

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病毒生长曲线
将100个基因拷贝数的病毒接种到含A549细胞的12孔板中，分别在感染后第6, 9, 12, 18, 21, 24, 36, 48, 72 h收获样品，反复冻融三次释放病毒，12000×g离心10分钟，取200ul上清提取病毒基因组，通过实时定量PCR扩增病毒E1基因检测各时间点的病毒基因拷贝数，计算病毒滴度。实验中，先将E1基因片段连接到T载体中，稀释成不同的浓度，作为实时定量PCR实验的标准品。
比较了两个病毒的病毒生长情况，一个是本次武汉ARD爆发的流行株，一个是CDC228病毒株（VA RNA基因末端是完整的，没有核苷酸的缺失），结果显示本次流行株病毒生长能力比CDC282要快一些。

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本文报道了一个在大学生群体中由HAdV-7引发的ARD爆发，169入院治疗，其中8例进ICU治疗。六邻体蛋白和纤维蛋白是HAdV血清型分型的主要抗原决定簇，在先前报道的两起HAdV-7 爆发事件中，我们发现除了在VA RNA基因中有12个核苷酸的缺失外，其它基因几乎没有核苷酸的突变。本文中首先分析了六邻体蛋白，纤维蛋白，VA RNA基因，发现在VA RNA II区存在差异。另外，全基因组测序发现在DNA聚合酶基因有两处氨基酸突变，但是不是位于DNA聚合酶的功能区。这些结果提示将来对于HAdV7感染的监测中，应该对VA RNA II基因多加关注。