噬菌体抗体库技术--鼠源性噬菌体Fab抗体库的构建

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噬菌体抗体库技术是制备重组抗体的主要方法之一。该技术可避免复杂的细胞杂交瘤技术，直接从基因水平制备特异性单链抗体，简便、快速，被认为是继杂交瘤技术后抗体生产技术的又一次革命。

噬菌体抗体是噬菌体表面表达有抗体分子Fab或单链抗体的单链噬菌体(或称纤丝状噬菌体，最常见的如M13)，这种表面表达是通过Fab或单链抗体与单链噬菌体外壳蛋白(PⅢ或PⅧ)形成融合蛋白而完成的。将噬菌体载体转化细菌后，能够融合表达在噬菌体颗粒表面上的Fab 或scFV。

通过多轮的抗原吸附-洗脱-扩增，最终筛选到的所需的噬菌体抗体。筛选到的噬菌体抗体克隆可应用插人琥珀突变子及不能通读琥珀突变的受体菌获得可溶性的Fab 或ScFv。

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小鼠Fab抗体库构建的实验流程图

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STEP 1:  小鼠免疫和脾RNA提取 RT-PCR获得第一链cDNA

操作流程如附件PROTOCOL

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STEP 2:  小鼠Fab基因的PCR扩增

引物序列和操作流程如附件PROTOCOL

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STEP 3:  制备电转感受态细菌 准备进行轻链基因库的构建

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STEP 4:  轻链基因库的构建

获得纯化的抗体Fd片段和轻链LC（light chain）片段后，先后将轻重链基因插入到噬菌粒载体中。一般建库时可以先克隆轻链，因为重链在抗体的功能方面起着主要的作用，先克隆轻链后克隆重链有利于提高抗体库的多样性。

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STEP 5:  完成噬菌体Fab抗体库的构建

获得纯化的抗体Fd片段和轻链LC（light chain）片段后，先后将轻重链基因插入到噬菌粒载体中。一般建库时可以先克隆轻链，因为重链在抗体的功能方面起着主要的作用，先克隆轻链后克隆重链有利于提高抗体库的多样性。

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STEP 6 : 准备辅助噬菌体

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STEP 7：噬菌体抗体库的呈现
噬菌体展示技术(Phage DisplayTechniques，PDT)是一项筛选技术，将多肽或蛋白质的编码基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。
编码该融合子的DNA位于噬菌体颗粒中，这样使得大量多肽与其DNA编码序列之间、表型与基因型之间建立了直接联系。噬菌体展示技术是被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合，使各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）通过淘选得以快速鉴定。

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实验流程完整版已经整理上传至公众号 soberreading硕博园