三种不同腺病毒基因组提取方法对全基因组克隆构建的影响分析

黄帮主

三种不同腺病毒基因组提取方法对全基因组克隆构建的影响分析

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【摘要】
目的：建立一种简单、快速、有效、纯度高的人腺病毒全基因组提取的方法。
方法：用①Hirt s改良法、② 试剂盒A(High Pure Viral Nucleic Acid Kit：Roche．Cat：11858874001）、 ③ 试剂B(Mini BEST Viral RNA／DNA Extraction Kit Ver．5．0，Takara，Cat：9766）提取HAdV7 CQ1198病毒株全基因组
结果：几种方法都成功获得高质量的腺病毒全基因组，可以用于PCR、测序、酶切、同源重组和转染实验；
结论：
两种试剂盒方法较传统的Hirt S改良法更快，不需要特别步骤去除细胞基因组，可替代传统Hirt S提取方法用于快速提取高质量腺病毒基因组，提取的基因组能用于酶切分型、转染等实验操作。

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第一种方法：改良Hirt's法提取腺病毒基因组
具体方法见附件整理版protocol

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第二种方法用 试剂盒A(High Pure Viral Nucleic Acid Kit：Roche．Cat：11858874001）
具体操作步骤见附件

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第三种方法提取 TAKARA Mini BEST Viral RNA／DNA Extraction Kit
CAT 9766
微量样品即可提取出病毒DNA/RNA

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腺病毒基因组提取的3种方法比较
注：文中后文提到病毒液用量为60 mm培养皿中收获的感染细胞。TAKARA和ROCHE试剂盒适合微量病毒液提取，改良hirt‘s法可以提取大量病毒液。
使用试剂盒提取前可能进行了浓缩？
如果三种方法最初使用的病毒液用量一致，下表比较能看出：
与Hirt S改良法相比，试剂盒A法和试剂盒B法只需要30 min左右，提取时间显著缩短．提取的DNA含量显著增多，基因组拷贝数更大，其中，试剂盒A法提取的DNA含量最多以及基因组拷贝数最大；

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3种方法提取的病毒基因组用Hind11限制性内切酶酶切，电泳条带与理论酶切图谱相符。
酶切反应体系，病毒基因组初始体积数一致，可见试剂盒提取的DNA浓度要高。
但是Hirt法提取基因组起始病毒量可以加大体积，产量高，成本低，因此现在可以继续使用这个方法提取基因组DNA。

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腺病毒基因组DNA具有感染性，用DNA转染细胞能重新得到拯救出的病毒。
各取1ug提取的病毒基因组，用脂质体转染试剂转染AD293细胞，转染8d后，收集细胞，冻融3次后转接A549细胞，观察细胞病变效应。
3种方法提取的病毒基因组转染AD293细胞后都能成功拯救出病毒，其中试剂盒A和试剂盒B的病毒拯救效率相似，高于Hirt S法(图2、表2)。

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三种提取方法拯救的病毒，其感染A549细胞的生物学特性无差别(图3)

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3种方法提取的病毒基因组与穿梭载体在BJ5183感受态细菌内同源重组，全基因组克隆构建的成功次数中试剂盒法最多，与Hirt S改良法相比，提取DNA重组后菌落数试剂盒A法约3800个，试剂盒B法约9000个，菌落数显著提高。差异有高度统汁学意义(P<0．01)。见表2。