Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of severe acute respiratory

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Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of severe acute respiratory syndrome coronavirus

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摘要笔记：
引起SARS病原体为一个新出现的冠状病毒。本研究中通过扩增6个PCR片段，组装成Urbani毒株的全长cDNA基因组，电转细胞后收获到拯救病毒。拯救病毒复制能力和野生毒株一致，并且都受蛋白酶抑制剂E64-d的影响，病毒复制能力受到抑制。
另外，验证了拯救病毒和野生毒株的亚基因组都从共同序列ACGAAC开始进行转录。
感染性克隆的构建为基因组操作，筛选疫苗和药物提供了便捷的手段。

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2002年秋，SARS起源于广东，感染性强，致死率约为14-15%，在人为干预后，疾病得到有效控制。发病人数8000多例，死亡人数为八百多人。
SARS基因组为为正链RNA，长29700nt。

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实验用到的材料：
SARS病毒Urbani(Tor-2) 和Canadian毒株(Tor-7)
VeroE6细胞上进行增殖，滴度测定。
噬斑实验中，病毒以MOI=0.1感染细胞
蛋白酶抑制剂E64-d用于病毒活性检测。

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全长感染性克隆构建策略
基因组分为6个片段，提取病毒基因组RNA，RT-PCR得到六个片段（A-F)分别插入到Topo II TA (Invitrogen)或者pSMART载体中。

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扩增SARS 基因组不同片段所用引物

黄色标记为Pml I酶切位点。

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在扩增过程中，亚克隆出现一些点突变，通过Aar I酶切位点进行小片段连接，进行突变位点的修复

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将 A+B, C+D, E+F片段进行体外连接，4℃连接过夜，纯化后进行体外转录，获得SARS全长RNA。因为SARS N蛋白的转录子能增强全长RNA的感染性，所以通过PCR扩增获得N基因的全长片段，在上游引物添加SP6启动子，体外转录获得N蛋白的转录子。
上游引物：5-nnggcctcgatggccatttaggtgacactatagatgtctgataatggaccccaatc
荧光标记处为SP6启动子。

下游引物：5-nnnttttttttttttttttttttttttttatgcctgagttgaatcagcag-3

SARS全长RNA或者SARS全长RNA+N转录子两种方式电转BHK-21细胞。

48小时后，共转RNA能产生1×10^6units/ml的病毒，单转RNA也能产生病毒，但是滴度要低一些。

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SARS-CoV全长转录子电转BHK-21细胞后，Ab荧光检测感染性。
(A)单转SARS全长转录子. (B) SARS全长转录子和N转录子共转染。(C) 空白对照.
(D)转染后96小时的病毒生长曲线。
(E) Vero E6细胞上用噬斑实验检测拯救病毒和野生病毒。

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病毒颗粒进入宿主细胞后，依赖宿主的翻译系统，直接从基因组正链RNA的5‘端翻译出复制酶，复制酶是以RNA为模板的RNA聚合酶，在复制酶的作用下，基因组RNA直接转录为全长的互补负链RNA。负链RNA再转录为正链RNA和一组mRNA，这一组m'RNA即称为亚基因组mRNA。
亚基因组mRNA都具有5’甲基化帽子和3‘-同末端成套结构，且都含有长度约为72nt的一段先导序列。基因间通常有一个保守序列CUAAAC，被称为TRS