Primary Studies on Fermentation Conditions of the Recombinant Human...

傲慢与偏见

Primary Studies on Fermentation Conditions of the Recombinant Human Keratinocyte Growth Factor-2

傲慢与偏见

摘要
目的：人角质细胞生长因子-2 (hKGF-2) 对烧伤、割伤等造成的皮肤损伤具有良好的促进修复和愈合功能，在临床、化妆品等方面具有极大的应用潜力。为此，人角质细胞生长因子-2的规模化生产和制备成为开发应用的一项重要前提。
方法：本文利用正交实验设计，在摇瓶条件下优化了培养基组分和pH等培养条件对大肠杆菌工程菌[Pet26b/KGF-2/BL(DE)21]细胞生长和重组hKGF-2表达的影响。
结果：工程菌生长及表达的最优培养基组分和条件确定为葡萄糖10 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母提取物10 g/L、pH7.5及IPTG诱导时间5~6 h。最后，
在100升的BLBIO-15SIA发酵罐中以优化的发酵条件进行了3个独立批次的发酵实验，工程菌的生物量达到100 g/L (DCW)、重组人角质细胞生长因子-2表达量占全细胞总蛋白约为30%。
结论：为进一步人角质细胞生长因子-2 (hKGF-2) 的中试开发奠定了基础。

傲慢与偏见

背景资料：
角质细胞生长因子-2 (keratinocyte growth factor-2，KGF-2)，又名成纤维细胞生长因子-10 (FGF-10)，属于成纤维细胞生长因子超家族的成员。
hKGF-2 编码208 个氨基酸残基，其中N-端40 个氨基酸残基组成信号肽序列，成熟的人KGF-2 相对分子质量约为19.3 kD。
hKGF-2特异性作用于上皮细胞的成纤维细胞生长因子受体(FGFR-2b)，
对烧伤、溃疡、切割伤的修复与再生比其他生长因子具有更显著的促进愈合和减少瘢痕的作用；
对体外培养的人角膜上皮细胞有明显的促生长作用；
可提高辐射后小鼠肠干细胞的存活率；
对辐射引起气道上皮细胞的通透性升高具有拮抗作用，可以加速辐射诱导的DNA 损伤的修复；
对维持细胞骨架蛋白F-肌纤蛋白的稳定和保护细胞间连接具有重要作用。
因此，KGF-2 很有希望发展成为临床上多功能的生物制剂。

傲慢与偏见

主要实验材料：
工程菌[pET26b/KGF-2/BL(DE)21]：根据KGF-2 成熟肽的编码序列及其特点，利用大肠杆菌密码子的偏爱性，设计、合成了编码人KGF-2 的基因序列，然后将KGF-2 基因克隆到大肠杆菌表达载体pET26b 中，构建pET26b- KGF-2原核表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)。

傲慢与偏见

种子培养基：LB 培养基，其配方含胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L，发酵时加入浓度为0.1 g/L 的氨苄青霉素。
制备种子液：
将保存于甘油中的大肠杆菌工程菌划线接种于LB 琼脂平板上(含0.1 g/L 氨苄青霉素)，37˚C 过夜培养。然后从平板上挑取单菌落，接种于5 mL LB 中；在37˚C、220 r/min 培养12 h。最后，取2ml扩种到100 mL LB 中，继续在37˚C、220 r/min 条件下培养至对数生长期，4˚C 保存。
基因工程菌的生长和诱导时间对目的蛋白表达的影响
大肠杆菌工程菌在LB 摇瓶培养3 h 后，A600 约0.5，此时进入对数生长期；
不加IPTG 诱导时，A600 在7 h 达到3.9。此时，细胞生长的对数期结束，进入稳定期。
当A600 达到1.0 左右时(培养时间4 h)，加入IPTG 诱导表达，然后每隔l h 取样，测定菌体密度和目的蛋白的相对表达量。当诱导5 h 时后，目的蛋白rhKGF-2 的表达量达到最大、此时约占全细胞总蛋白的21%，6 h 后表达量基本保持稳定。
摇瓶发酵表明rhKGF-2重组蛋白启动诱导表达的时间为4 h 左右，最适诱导表达时间为5~6 h。

傲慢与偏见

发酵培养基的优化：
以发酵培养基为基础，选定胰蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖及培养基pH 值等4 个因素，进行了三个水平的正交试验L9(3)。

四因素三水平是一个典型的正交表，可以分成9组的，做9组实验即可完成。A、B、C、D分别代表各个水平下的4个因素，1、2、3则代表3个水平，然后将其排列组合。

傲慢与偏见

摇瓶正交试验优化葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物的不同浓度及培养基初始pH 值（四因素）对大肠杆菌工程菌细胞的生长和rhKGF-2 蛋白重组表达的影
响。
结果显示各因素对rhKGF-2蛋白重组表达和菌体生长影响的作用大小依次为：pH 值>酵母提取物>胰蛋白胨>葡萄糖；
而且细胞密度与重组蛋白的表达水平呈正比。
根据结果归纳总结出rhKGF-2 重组表达的最佳培养基组合为：胰蛋白胨20 g/L、酵母提取物10 g/L，葡萄糖10 g/L，pH7.5。
酵母提取物和胰蛋白胨的最高水平效果最好，说明充足的氮源不仅促进大肠杆菌细胞生长，也能支撑重组蛋白高水平表达。
葡萄糖浓度过高时，过高的碳源会抑制细胞的生长和重组蛋白的表达。
葡萄糖浓度过低时，也会导致细菌生长和外源表达所需碳源和代谢能量不足。
因此，在大肠杆菌的培养基中添加适量的葡萄糖可以加快工程菌的生长速率，并缩短发酵周期。但要注意“葡萄糖效应”对目的蛋白表达的影响。

傲慢与偏见

为了验证正交试验得出的优化条件，以此条件（胰蛋白胨20 g/L、酵母提取物10 g/L，葡萄糖10 g/L，pH7.5）。进行了3 次独立的重复试验(图4，10~12 道)，结果显示大肠杆菌工程菌的细胞生长和rhKGF-2 的表达量均略高于正交试验中的9 个试验组合(图4，1~9 道)，三次独立实验中rhKGF-2 重组蛋白的相对表达量平均接近25%，细胞密度达到4.0 左右。

傲慢与偏见

发酵培养基：胰蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L，NaCl 5 g/L，K2HPO4 3.5g/L，KH2PO4 6.0 g/L，MgSO4 3.5 g/L，葡萄糖10 g/L，微量金属元素2 mL/L (每升微量金属元素含1.9 gCuSO4，0.012 g Na2MoO4，0.5 g 硼酸，0.012 g AlCl3，0.0144 g ZnCl2，0.162 g FeCl3，0.006 g CaCl2)。ph=7.5
在100升的BLBIO-15SIA发酵罐中进行了放大试验，进行3批发酵实验。
在含葡萄糖的大肠杆菌发酵培养基中，细菌的比生长率(μ)高，乙酸的产率也高，当大肠杆菌的比生长率超过临界值就会伴随乙酸的产生，乙酸浓度过大，
将抑制目的蛋白的重组表达。
因此，在工业发酵过程中，采用合理的操作方式(如恒速补料、变速补料等)控制葡萄糖的有效浓度。此外，通过提高搅拌速度和通气，以及及时补充细胞生长所需的营养物质，也能延长细胞的对数生长期，降低乙酸浓度。
提高菌体密度，保证目的蛋白的高效表达。
由于自动化的发酵罐有利于控制各种发酵参数，如增加搅拌和通气，因此比摇瓶发酵更能满足工程菌对氧气和营养的需求，所以发酵罐往往能够得到比摇瓶发酵更好的效果。

经测算，大肠杆菌工程菌的细胞生物量平均达到约100 g/L (DCW)，rhKGF-2 重组蛋白占全细胞总蛋白约30%，均超过小样培养时的水平，为重组人角质细胞生长因子-2 的中试和生产奠定了基础。

不错的一篇文章，能学到不少知识。