大容量人源天然噬菌体抗体库的构建

米小圈

大容量人源天然噬菌体抗体库的构建

米小圈

【摘要】
目的：构建大容量(>10^8)的人源天然噬菌体抗体库。
方法：提取人外周血淋巴细胞mRNA，反转录出cDNA第一链，以此为模板，PCR扩增重链(VH)和轻链(VL )基因片段。将VL 基因PCR产物插入含Loxp和Loxp511序列的pDF载体中，电转化大肠杆菌XL1-B1ue，构建轻链库，再将VH基因PCR产物插入轻链库载体中，电转化大肠杆菌XL1-Blue，构建初级库。进
一步用初级库超感染BS1365菌，使其vH 与vL 发生重组，获得重组库，再利用重组库感染大肠杆菌XL1-Blue，构建工作库。
结果：所有vH 和vL亚类基因的扩增产物片段大小均与理论值相符，轻重链基因的克隆效率均为100％。初级库容量为10^8，滴度为6×10^13；重组后的工作库有效容量为8×l0^10，滴度至少为1×10^13。
结论：已构建容量为10^10 的人源天然噬菌体抗体库。

米小圈

人源噬菌体抗体库中可以淘选到全人源化的基因工程抗体 ，为获得抗病毒、抗肿瘤以及自身免疫性疾病等的治疗用抗体开辟了新的途径。
临床治疗用的抗体需要低抗原性、高亲和性，必须构建库容量大、具有广泛多样性的人源抗体库，对于未经免疫的天然抗体库，则要求更高 。

米小圈

所用材料
大肠杆菌XL1-Blue，BS1365菌
噬菌体载体pDF，可用于Cre-LoxP定位重组的噬菌体抗体表达载体，带有V5标签和6xHis标签，g3基因，pelB信号肽，Amp抗性，与表达Cre重组酶的BS1365大肠杆菌配套使用，辅助噬菌体VCSM13。
150份人外周血清(共计300 m1)，分离淋巴细胞，备用。

米小圈

引物设计
重链5‘端引物HVH1扩增VH。的11个、VlI6的2个及Vm的1个成员，共14个
目的基因片段；HVH2扩增Vm的22个成员；HVH3
扩增Vm的3个成员；HVH4扩增VⅢ的11个及V瑙
的1个成员，共12个目的基因片段；重链3 端引物
为M3N。在重链5 端引人s I酶切位点，3 端引人
Nhe I酶切位点。
HVH1 5'-ATI．AGGCCCAGGCGGCCSAGCTSCAGCIBGTRCAC1、cTGG．3 (Sfi I)
HVH2 5'-ATrA SAGGTGCAGCTGKTGGAG-3 (Sfi I)
HVH3 5'-ATrAGGCCCAGGCGGCCCAGRTCACCTTGAAGGAGTCT-3 (Sfi I)
HVH4 5'-ATrAGGCCCAGGCGGCCCAGSTGCAGCTRCAGSAGT-3 (sfi I)
M3N 5'-GACGCr GGAGGCAGCTC．3 (Nhe I)