Completion of Kunjin Virus RNA Sequence and Recovery of an Infectious RNA Tra...

傲慢与偏见

Completion of Kunjin Virus RNA Sequence and Recovery of an Infectious RNA Transcribed from Stably Cloned Full-Length cDNA

傲慢与偏见

摘要：
kunjin病毒是目前报道的黄热病毒属中基因组最长的病毒，全长基因组为11022bp长。
5-UTR区有96个核苷酸，3-UTR区有624个核苷酸，在紧邻终止密码子46位核苷酸的区域中有一个插入位点。
本研究中构建的kun感染性克隆在基因组前加SP6启动子，4049位进行点突变，去除BamH I酶切位点作为遗传标记。
该感染性克隆在DH-5α中很稳定，在基因组两端添加的多余核苷酸在体外RNA中存在，但是在拯救病毒的RNA中不再存在。
拯救病毒和母株病毒相比，噬斑变小，在细胞和小鼠中生长变慢，其他的一些指标，如感染滴度，神经毒性等等和母株一致。
kun感染性克隆的构建为后续病毒基因功能检测提供了有效的工具和手段

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背景资料摘抄：
KUNjin病毒是一个在澳洲偶有流行的黄热病毒属病毒。本文首次对KUNjin病毒进行全长测序。
结合末端测序以及羧肽酶消化技术。对几个NS蛋白读码框进行准确的定位。
进一步表达了几乎所有的junjin病毒蛋白，除了已知的几个，如NS5,NS3,NS2B/3的功能外，其它的功能尚需研究。
本文描述了UTR区的测序工作，另外构建了KUnjin的感染性克隆，得到了表型略有改变的拯救病毒，本研究感染性克隆的构建主要用于对病毒蛋白的功能研究中。

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实验用材料：Vero和BHK-21细胞。
kunjin MRM61C野生毒株

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对KUN RNA的两个末端进行核苷酸测序
提取病毒RNA，用烟酸焦磷酸酶去除5端帽子，RNA连接酶进行连接，
通过反转录获得第一链cDNA，特异性引物用5' GCCCGGGTCGGAGCAATT 3'，和基因组的173-190位互补。
以CDNA为模板，扩增得到一段长777bp的片段，包括5-UTR区的1-120bp和3-UTR区的10366-11022bp，进行测序。
确定5-UTR区为96个核苷酸，3-UTR区有624个核苷酸。
全长为11022个核苷酸。
kunjin和WNV高度相似，比较了两个病毒的UTR区。
其中，5-UTR区都是96个核苷酸，只有4处不同。
而KUN的3-UTR区比WNV的3-UTR比较多了53个核苷酸，比JEV的3-UTR区多了42个核苷酸。

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A：划单横线的AUG为起始密码子。划双横线的序列UGUCAAUAUGCU和3-UTR中的CS1互为环化序列，其中的UCAAUAUG是黄热病毒属中的保守序列。
B：3-UTR区存在保守序列CS1，CS2和RCS2序列，23nt，CS3和RCS3序列，16nt。C：5-UTR和3-UTR中的两短序列互补，形成锅柄状结构。
和WNV相比较，KUN在10399位多了一段46个核苷酸的序列，GENBANK上找不到相似的序列。

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KUN感染性克隆的构建

KUN基因组克隆到高拷贝质粒pBluescript中，克隆在平皿中生长非常缓慢，在液体中培养时也是增菌缓慢。
将该基因组转移到低拷贝pBR322中后，克隆生长恢复正常。

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体外转录病毒RNA，转染细胞，获得拯救病毒。

体外转录后产物和基因组比较，5端多了一个G，3端多了CGA。
根据转染试剂和操作的不同，分三种protocol进行转染。
在转染后第7天，RNA用量到5ug的转染组能观察到CPE。

收集上清感染BHK-21细胞，
第一代在感染后第56个小时病毒滴度能达到2.5×10^5。
第二代在感染后第30个小时病毒滴度能达到1.6×10^6。
按MOI=0.01感染BHK-21细胞，病毒滴度能到6×10^6。
其拯救病毒命名为AK病毒，后续实验和原野生病毒进行比较。

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AK拯救病毒中的遗传标记
在构建感染性克隆时，将原基因组中4049位的BAMH I位点进行点突变，去掉该酶切位点，但是不改变氨基酸序列。
拯救病毒获得后，提取病毒基因组，进行反转录PCR，对该位点进行测序鉴定，如预期，该位点依然是人工突变后序列。
进一步检测拯救病毒基因组5端和3端是否存在多余的碱基。
结果如图，体外转录时用的RNA存在有多余的碱基。
但是得到的拯救病毒，基因组RNA已经没有了多余的碱基，和野生株的基因序列完全一致。

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拯救病毒AK和野生毒WT的生物学活性鉴定。
AK噬斑略小，更为整齐。生长曲线略为延迟。
病毒滴度比较，WT在36小时能达到5×10^7；AK在48小时能达到9×10^7。
检测两种病毒在不同温度下的生长情况（37℃和39℃），病毒滴度没有太大改变，说明温度对病毒生长影响不是很大。