本帖最后由 cl181117 于 2020-5-14 17:41 编辑
实验结果：
1、重组NS1的制备 可溶性原核表达（E. coli TB1 cells）
2、 NS1特异性MAbs的产生和鉴定 用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术获得NS1特异性MAbs。 ELISA、WB证实MAb 3C7和4D1 与重组NS1结合能力强。 通过IFA对两种mAbs特异性进行进一步鉴定，表明MAb 3C7与WNV反应，但与JEV、DENV1-4、黄热病病毒(YFV)、阿尔蒂斯病毒(TBEV)和Tick-borne反应不明显，而MAb 4D1与WNV和JEV均有反应，但与其他非JEV血清复合黄病毒没有反应。MAbs 3C7和4D1的重链为IgG1，轻链为l型。3C7和4D1培养上清液的抗体滴度分别为1：256和1：512，腹水的抗体滴度分别为1：512000和1：1,024000。
3、 噬菌体随机12肽库筛选抗原表位 通过三轮连续生物筛选3C7和4D1抗体反应噬菌体得到大量富集，MAb 3C7三轮生物筛选的产出/投入比为0.00016%、0.023%和0.88%，MAb 4D1的产出/投入比为0.00018%、0.023%和0.89%。 噬菌体ELISA结果表明，与阴性对照无关的特异性MAb IFN-gM Ab(OD492nm<0.20)相比，每个MAb(C1-C10为3C7，D1-D10为4D1)的10个噬菌体克隆表现出特定的反应性(OD492nm>1.0)。 通过测序来确定插入序列，比对表明6个3C7反应克隆(C1-6)显示了一个一致的LTATTEK序列。 同样，四个4D1反应克隆(D1-4)揭示了VVDGPETKEC的另一个一致序列。这些一致的序列基序分别与WNV NS1序列895LTATTEK901和925VVDGPETKEC934相同。
4、 表达多肽，利用WB鉴定显示的表位 结果表明，MBP-CP-1(含CP-1肽的MBP-融合多肽：LTATTEK)和MBP-CP-2(含CP-2肽的MBP-融合多肽：TATTEK)被MAb 3C7识别，只有MBP-DP-1(MBP-融合多肽含有DP-1肽：VVDGPETKEC)被MAb 4D1识别。这些数据将TATTEK和VVDGPETKEC分别定义为3C7和4D1识别的线性表位。 5、 WNV/JEV阳性血清与已鉴定NS1表位的反应性 含有这两个表位的重组蛋白被WNV阳性马血清识别(图6a，b)，而WNV阴性对照马血清则不识别(图6c，d) )。 进一步的交叉反应检测表明，多肽Dp-1(VVDGPETKEC)可以与6个JEV阳性马血清反应(图6e)，但CP-2(TATTEK)没有被任何JEV阳性马血清所识别(图6f)。
6、 序列相似性和交叉反应性 从18个不同WNV分离株NS1序列的分析表明，3C7表位TATTEK在包括昆津病毒株和WNV谱系5株在内的WNV谱系1株中高度保守的（EU249803；图7a）。 在WNV系2、3和4株中存在有限的氨基酸突变(图7a)。 值得注意的是，序列基序在Flaviviridae家族的其他成员中不保守，包括JEV血清复合物的其他病毒(图7a)。我们还对4D1mAb识别的最小线性表位进行了序列比对。 基序VVDGPETKEC是JEV系列成员的共同表位，包括WNV、JEV、MVEV和SLEV 但没有非JEV的Serocomplex成员的家庭(图7b)。
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发表于 2020-5-14 17:20:02
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