Molecular and Biological Characterization of Human Monoclonal Antibodies...

潇湘妃

Molecular and Biological Characterization of Human Monoclonal Antibodies Binding to the Spike and Nucleocapsid Proteins of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus

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文章骨架：
材料和方法：
Virus preparation
Selection of SARS-CoV-binding clones by phage panning
Human IgG antibody production and purification
Immunofluorescence
Expression of N and soluble truncated S glycoproteins
Construction of variant S318-510 fragments
Target identification with ELISA
Competition ELISA.
Epitope mapping
Electron microscopy.
Flow cytometry analysis.
Neutralization assay.
Data deposition.

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结果
Selection and identification of MAbs to SARS-CoV
Specificity of MAbs for SARS-CoV.
Characterization of antibodies binding N.
Analysis of N binding by EM
Characterization of antibodies binding S protein
Inhibition of binding of S565 to Vero cells
In vitro neutralizing activity of antibodies to SARS-CoV.

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摘要：
用灭活的SARS病毒作为靶蛋白，从半合成人噬菌体抗体库中筛选到八个能和病毒结合的抗体。
其中2个抗原表位位于N蛋白，4个位于S蛋白。
2个N蛋白抗体的抗原表位一个为线性表位，序列在所有的人和动物SARS毒株中均保守存在。另一个抗体识别空间表位。
抗S蛋白的四株抗体，其中3个能S1蛋白的318-510位结合，该区域为RBD结合区，抗体和SARS-COV有竞争结合。

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SARS病毒，2002年作为一个新型感染性疾病首先在广东流行，2003年，传播至30多个国家，8000个病例。
老年患者的死亡率约为55%。患者体内分离到新的冠状病毒，
SARS感染后经过6-10天潜伏期，临床进程差异很大，20%患者呼吸衰竭，死亡率约10%。
10-15天患者血清中能检测到抗体，伴随病毒含量下降。
感染病毒的小鼠动物模型中病毒复制和产生中和抗体的进程和人很像，被动免疫血清多抗显示在小鼠模型中肺泡病毒滴度有所下降。
用抗体进行免疫预防可能是控制SARS的一个有效途径。

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SARS冠状病毒识别受体为ACE2，冠状病毒的受体结构区定位于S1蛋白的318-510位。
S1蛋白是病毒中和抗体结合的靶蛋白，位于S蛋白N端1-672位。
Sui等通过抗体噬菌体库筛选出针对S1蛋白的第一个人源性单抗，其中有一个抗体（80R？）能通过阻断病毒和ACE2结合，降低感染性从而发挥中和作用。
近来有文献报道称病毒其它蛋白也存在中和抗体表达，诱导产生中和抗体。
因此，本研究以全病毒颗粒作为靶蛋白，对抗体库进行筛选。
最终得到2个针对N蛋白的抗体，4个针对S蛋白的抗体。

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本研究中用到的实验材料
SARS病毒颗粒，已经经过γ-照射后的灭活病毒。
半合成人噬菌体抗体库

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筛库：
以SARS灭活病毒颗粒作为 靶抗原，经过2-3轮筛选，从1138个单克隆中筛选到96个针对SARS-COV的特异性抗体。
序列分析得到八组特异的序列。其中VH序列有8个，VL序列有3个。
8个VH序列均来自胚系基因VH3.
CR3006和CR3015单抗VL序列分别来自VkI和Vλ3的A20和V2-13胚系。
而另外六个单抗VL序列来自VkI的O2胚系基因。
筛选到的八个单链抗体序列如下：

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合成全抗，表达纯化，鉴定
8个单链抗体均改造为全抗，首先，ELISA检测抗体和灭活后的全病毒颗粒结合能力。
8个抗体均能结合，结合能力有所差异。

进一步用IFA检测活病毒感染的VERO细胞。
结果均显示阳性。

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N蛋白和截短S糖基化蛋白的原核表达
N蛋白基因来自FM1株病毒，插入到真核表达载体pAdapt/myc-HisA中，该载体C末端带有myc和HIS标签。
S蛋白基因进行序列优化，取N端前565个氨基酸插入同样的表达载体pAdapt/myc-HisA。
取318-510位氨基酸插入到 真核表达载体pHAVT20/myc-HisA中构建pHAVT20/myc-HisA S318-510，其中S基因的318-510位和HAVT20前导序列进行融合，前面为CMV启动子。
上述质粒分别转染293T细胞，进行瞬时表达。
裂解细胞后得到可溶性N蛋白，截短蛋白在上清中有分泌表达，镍柱进行纯化。