7型腺病毒温州株基因组主要序列的克隆与分析

傲慢与偏见

7型腺病毒温州株基因组主要序列的克隆与分析

本帖将此文结合作者硕士论文一起阅读，进行笔记记录。

傲慢与偏见

目的：克隆和分析7型腺病毒温0'1’I株(Ad7wz1)基因组主要序列ITR、E1A261R、E1B55kDa、Hexon和E3。
方法： 分离并提取了Ad7wz1基因组DNA，PCR扩增得到各基因后利用PMD18 simple T载体进行克隆，并测序分析。
结果： 获得AdTwz1 ITR—L、E1A261R、E1B55kDa、Hexon、E3和ITR—R六个基因的克隆，并测得核苷酸序列；分析表明其核苷酸序列和相应的氨基酸序列与GenBank上已发表的Ad7全基因组序列比较同源性分别达到93．2％～100％和97．8％～i00％。
结论：初步确定本次分离的Ad7wz1毒株为Ad7d2型，Ad7wz1与已经发表的Ad7病毒株序列有高度同源性， 为研究Ad7的致病机制提供了重要的理论基础。

傲慢与偏见

Ad7与人类的呼吸道疾病密切相关，据WHO调查表明，全世界范围内Ad所导致的人类疾病中，约1/5由Ad7引起，尤其儿童感染Ad7会产生重症呼吸道疾病甚至死亡。

傲慢与偏见

实验材料：
A549细胞，用10%FBS的F12培养基进行培养。
病毒：Ad7wz1
PMD18 simple T载体，pXBL载体菌株BJ5183，EZ10

傲慢与偏见

A549细胞感染痰液腺病毒5～7 d后即引起细胞肿胀、变圆、聚集成葡萄串珠状的典型细胞病变。感染7-8天，CPE达到80-100%，收获病毒，提取基因组。

傲慢与偏见

根据GENBANK:AY495969设计六对引物
用PCR扩增ITR—L、E1A261R、E1B55kDa、Hexon、E3、ITR—R六个片段。
片段大小：ITR-L(500 bp)、E1A261R(780 bp)、E1B55kDa(1 400 bp)、Hexon(250 bp)、E3(1 200 bp)、ITR—R(514 bp)
PCR产物与PMD18 Simple T载体连接并转化，提取质粒后测序。

傲慢与偏见

Ad7wz1基因组主要序列和Genbank上5个Ad7基因组进行核苷酸和氨基酸序列比对。
对序列突变位点进行分析，有多点发生突变。

傲慢与偏见

在硕士论文中第二部分继续构建HADV7感染性克隆

合成引物

P15:TTGCGGCCGCGGGTTTAAACCCCTCTCTATTTAATATACCTTATAGATGGA

P16：CCGAATTCCTCTGTTCTGTCCACTGGTCGTA

从基因组中扩增出2200bp左右的条带，位于腺病毒的左端。

P17：CCGAATTCGAGTTGCTTCCTGACATTCTCGTAT

P18：CGGGATCCGGGTTTAAACCCCTCTCTATATAATATACCTTATAGA

从基因组中扩增出1800bp左右的条带，位于腺病毒的右端。

先后插入到T载体中，利用ECoR I线性化该质粒，和HAdV7基因组共同转化BJ5183细菌中，通过同源重组获得腺病毒的感染性克隆。

构建的质粒线性化后转染A549细胞，能获得拯救病毒。

论文里的这部分内容操作有些复杂，可以简化。