Recent advances in therapeutic applications of neutralizing antibodies for vi...

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Recent advances in therapeutic applications of neutralizing
antibodies for virus infections: an overview

中和抗体在病毒感染治疗中的应用进展

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摘要：
抗体被认为是中和病原体的良好基础，也是高度特异的治疗剂。抗体是机体对疫苗的免疫反应而产生的，但很少用作免疫疗法来对抗病毒感染。新一代广泛交叉反应和高度有效的抗体为它们作为医学干预手段提供了一个独特的机会。中和抗体(单克隆抗体和多克隆抗体)是制药产品所需要的，因为它们能够通过精确的中和机制来靶向具有可变区的特定表位。通过噬菌体展示抗体库、转基因小鼠、B细胞方法和杂交瘤技术，已经实现了中和抗病毒抗体的分离。抗体工程技术带来了疗效的提高，进一步提高了抗体在体内的活性。虽然中和抗病毒抗体有一些局限性，阻碍了它们作为治疗剂的充分发展，但其预防和治疗一系列病毒(HIV、埃博拉、MERS-COV、CHIKV、SARSCoV和SARS-CoV2)感染的潜力，正在积极地进行人体临床试验。
关键词：体液免疫反应、表位、多克隆/单克隆中和抗体、噬菌体展示、糖蛋白

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抗体是免疫系统在检测到被称为抗原的异物时产生的一种保护性蛋白质。1890年，Emil von Behring和Shibasaburo Kitasato在暴露于白喉或破伤风毒素的动物的血液中发现了抗体作为保护性抗毒素。到目前为止，抗毒素仍被用作预防和治疗某些感染的选择。由于抗体在获得性免疫中的关键作用和广泛的特异性，抗体一直是一个重要的研究课题。虽然疫苗的目的是诱导宿主细胞产生抗体，但病毒株的高基因突变率增加了病毒重新激活的可能性(由于抗体特异性的丧失)，这可能导致无效的疫苗接种，就像HIV-1的情况。
抗体已被用于疫苗的开发，但很少被用作对抗病毒感染的生物疗法。新一代广泛交叉反应和高度有效的抗体为干预带来了独特的机会。抗体是制药产品所需要的，因为它们有能力通过其可变区来靶向特定的表位。
抗病毒抗体是病毒学家用来更好地了解病毒结合和进入宿主的确切机制以及它们的抗病毒免疫的独特研究发现。根据作用机制，抗病毒抗体可分为中和性抗体和非中和性抗体。中和抗体通过结合病毒被膜上的特定表位而发挥作用，并通过多种机制中和病毒感染，特别是在针对多种病毒的临床试验中，中和抗体已经显示出很大的进展。在非中和抗体中，抗体结合到病毒表面的某个区域，而不中和感染或完全清除病毒滴度。由于抗体不能阻断感染，整个病毒-抗体复合体通过内吞作用进入细胞。然后，其他非中和体液效应器功能表现为抗体依赖的细胞介导的细胞毒(ADCC)或抗体介导的吞噬、聚集，甚至免疫激活。
治疗性抗体用于对抗癌症、自身免疫性疾病和被动抗体治疗感染性疾病的多功能性已在过去进行了综述；然而，这篇综述文章主要集中在使用中和抗体作为已建立的人类治疗性抗病毒疗法的最新进展，包括抗体如何中和病毒，它们的临床应用，有效和广谱中和抗病毒抗体的分离，以及中和抗病毒抗体的局限性。

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中和抗体(NABS)

中和抗体(NAB)是一种通过中和或抑制其生物学效应来保护宿主细胞免受病原体侵袭的抗体。它能阻断病毒被膜与宿主细胞受体的相互作用，或抑制病毒基因组的释放。在不同约束下出现的NAB是更好地理解体液免疫反应的哨兵，也为免疫疗法的未来发展提供了更大的潜力。Nabs是成功预防疾病的基础；然而，对于丙型肝炎病毒(HCV)和艾滋病病毒(HIV)等严重的慢性感染，使用来自重组疫苗的有效而广泛的nabs是不完整的。NABS可以抑制一种特定病毒的多种毒株；仅次于疫苗接种，中和抗体对病毒感染提供了最好的保护，而不是抗逆转录病毒疗法ART。

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单克隆抗体(MAb)

单克隆抗体(MAb)只有一种免疫球蛋白，具有明确的特异性和单一的同工型。这些类型的抗体在临床上用于对抗特定的抗原，并通过抗原结合片段(Fab)显示出治疗效果。最近，在欧洲和美国，大约80种单克隆抗体已经被批准，其中数百种正在进行临床试验。在过去的十年里，大量的抗体被设计出来，包括新型的抗体类支架、抗体-药物结合物和双特异性抗体。近年来，发展起来的分离技术从免疫源和非免疫源产生人源化mAb，并在利用抗体进行治疗方面取得了显著进展。抗病毒单抗被认为是根除慢性感染暴发的一种新的免疫疗法。抗病毒单抗具有以下特征：
a)针对特定表位的能力，
b)高度特异性，
c)高效力，
d)临床应用中副作用最小，这有助于并鼓励大规模生产。

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多克隆抗体

多克隆抗体是一组不同的抗体，在感染过程中针对病毒包膜上的许多表位，并提供强有力的中和活性。多克隆抗体靶向多个表位的能力使它们能够触发一系列效应功能，如空间位阻(防止抗体-病毒复合体附着在宿主表面)、聚集(抗体与许多病毒结合导致它们清除循环)、调理(激活吞噬细胞)和激活补体系统。与单克隆抗体相比，多克隆抗体具有成本低、生产周期短、稳定性高、亲和力强等优点，而且多克隆抗体对抗原变化的敏感性低于单克隆抗体。相反，由于它们缺乏特异性和多克隆抗体的高度交叉反应性，限制了它们在临床上的应用。

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噬菌体展示抗体库

噬菌体展示是一种利用噬菌体(感染细菌的病毒)来表达一种独特的蛋白质变体(如抗体片段)的现代技术。在噬菌体展示中，编码感兴趣蛋白的基因被插入到噬菌体中，使噬菌体在外部展示该蛋白，同时在内部包含该基因，从而导致基因型和表型之间的联系。噬菌体展示始于目标抗体的重链和轻链基因的扩增和重组噬菌体展示质粒的构建。一旦细菌被噬菌体和辅助噬菌体混合感染，噬菌体将被复制、翻译和组装成具有感染性的噬菌体，目标单克隆抗体片段显示在噬菌体表面。
噬菌体展示进一步用于筛选具有独特性质的抗体，即噬菌体抗体库技术。这一过程从制备抗体库开始，然后将可变重链和可变轻链PCR产物连接到噬菌体中。然后对克隆的单克隆抗体进行分析(图1A)。为了从克隆的免疫球蛋白库中分离出特异性的单克隆抗体，需要一个庞大的抗体库和有效的筛选。该文库通过一种名为生物扫描的表面单克隆抗体生物技术来筛选噬菌体与抗原的结合。需要进行多轮噬菌体与抗原的结合、洗涤、洗脱和噬菌体洗脱液的繁殖。在每一轮中，通过洗掉不能结合的噬菌体并有选择地洗脱结合噬菌体克隆，从池中挑选出特定的噬菌体克隆。3或4轮后，噬菌体克隆通过表面图谱的高度特异性结合是在固定化抗原上进行定向选择的特征(图1A)。这项技术已被应用于分离可能导致多种病毒(严重急性呼吸综合征(SARS)、埃博拉病毒、黄热病病毒、丙型肝炎病毒、麻疹病毒、狂犬病病毒和流感病毒)的中和抗体。此外，利用酵母噬菌体展示技术已经产生了抗HIV-1的新型mAb。

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转基因小鼠技术

这项技术需要克隆表达mAb的人B细胞。一个人类微型免疫球蛋白基因位点被插入到转基因小鼠中(图1B)，然后从免疫的转基因小鼠中分离并克隆表达人mAb的B细胞，这一过程首先将所需的抗原注射到小鼠体内，直到小鼠产生免疫反应，然后从小鼠的脾中分离出的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合，从而产生永生化的B细胞骨髓瘤杂交瘤。然后对产生的抗体进行筛选，找出所需的mAb。利用该技术已成功分离出狂犬病和急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)的抗病毒抗体。此外，分离的(5F10和8B10)单抗在体外对CHIKV感染表现出广泛的中和作用，20个异亚型单抗对流感病毒有良好的中和效果。

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单B细胞技术

这种分离技术既可以从外周血中以抗原性选择性的方式进行，也可以以随机的方式进行。根据转化方法的不同，从病毒感染恢复期的患者的血液中收集的记忆B细胞被EB病毒(EBV)和多克隆记忆B细胞激活元件转化，如辐照的单核细胞和CpG寡核苷酸(图1C)这些激活元件是TLR4(Toll-like Receptor 4)配体，具有极高的转化效率。非人灵长类动物(NHP)的B记忆细胞和血浆可以生产Nab。例如，从登革热和H1N1流感的恢复者身上分离出从记忆B细胞中产生的NAb。

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杂交瘤技术与人源化

杂交瘤是从非人类来源生产治疗性抗体的最常规技术。然而，还需要一个称为人源化的进一步过程。20世纪70年代中期，塞萨尔-米尔斯坦的团队发现了杂交瘤技术，从而从小鼠身上分离出具有独特特性和中和能力的单克隆抗体。人源化是通过移植互补决定区(CDR)来实现的，CDR决定抗体的结合位点。将啮齿动物供体mAb可变区的适当框架区域嫁接到受体人抗体框架上(图1D)。它可以保留单抗的特异性和结合亲和力，并具有较低的免疫原性风险。聪明的抗体筛选方法和对人类捐献者的适当选择导致了对几种病毒的稀有、广泛(NAB)的更好的分离。