Humanization of Murine Neutralizing Antibodies against Human Herpesvirus 6B

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Humanization of Murine Neutralizing Antibodies against
Human Herpesvirus 6B

小鼠抗人疱疹病毒6B(HHV-6B)中和抗体的人源化

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摘要：
皮疹是一种常见的儿童疾病，由人类疱疹病毒6B(HHV-6B)原发感染引起。它偶尔会并发发热性癫痫，甚至脑炎。HHV-6B的重新激活也会导致脑炎，特别是在异基因造血干细胞移植后。然而，目前还没有针对HHV-6B的足够的抗病毒治疗方法。鼠源性抗HHV-6B包膜糖蛋白复合体Gh/g1/gQ1/gQ2的单克隆抗体(MAb)已被证明能中和病毒感染。这些抗体有可能成为针对HHV-6B的抗病毒药物，尽管它们对人类免疫系统具有固有的免疫原性。将来自其他物种的单抗人源化是解决这一困境的有效方法之一。在本研究中，我们构建了抗HHV-6B的两株中和单抗的嵌合形式，以制备人源化抗体。两者都表现出与其原始形式相同的中和活性。这是首次报道人源化抗HHV-6B抗体，为进一步开发HHV-6B特异性抗病毒药物奠定了基础。

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前言：
1、HHV-6B是一种普遍存在的病毒，初次感染HHV-6B通常会导致常见的儿童发热性疾病，被称为3日热或亚急性皮疹(Exanome Subitum)。
2、目前还没有针对HHV-6B的既定预防或治疗方法。
3、近年来，单抗在从恶性肿瘤到自身免疫性疾病的治疗方面取得了巨大的成功，已有50多株单抗获得了美国食品药品监督管理局(FDA)的批准。已被批准用于预防呼吸道合胞病毒(RSV)感染的单抗Palivizumab(Synagis)就是一个成功的例子。
4、事实上，单抗有可能成为预防和治疗HHV-6B感染的候选药物。
5、以保守的糖蛋白H(Gh)-gl为基础的糖蛋白复合体被称为病毒配体。它与其细胞受体结合，然后通过与融合蛋白gB协同介导病毒被膜和细胞膜之间的膜融合。
6、在我们最近的研究中，我们确定Gh/g1/gQ1/gQ2复合体是HHV-6B细胞受体人CD134的配基。
7、尽管Gh/g1/gQ1/gQ2的具体功能尚不清楚，但Gh/g1/gQ1/gQ2至少有两个功能：识别受体和激活gB融合活性。GQ1是受体识别的关键成分，gQ2可能有助于其作为伴侣的功能。另一方面，Gh和Gl可能参与了Gb的激活。
8、在以往的研究中，我们已经证明了抗gQ1的鼠源性单抗KH-1对HHV-6B感染有很强的中和活性，抗GH的鼠源单抗OHV-3也被证明能中和HHV-6B感染。然而，小鼠单抗的固有免疫原性需要降低以用于临床。
9、在这项研究中，我们利用抗体工程技术人源化了两株中和单抗：抗gQ1的KH-1和抗Gh的OHV-3。进一步分析表明，新构建的鼠人嵌合单抗的中和活性与原鼠单抗相当。这些结果有力地表明了人源化方法中和抗HHV-6B单抗的实用性及其临床应用的可能性。

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结果：

1、人-鼠嵌合单抗表达载体的构建:
为了使鼠源性中和单抗人性化，我们为每个单抗设计了一种由鼠可变域和人恒定域组成的鼠-人嵌合形式(图1A)。将重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列分别与pFUSE-CHIG-HG1和pFUSE2-CLIg-HK载体中编码的人IgG1重链和人IgG(k)轻链恒定区序列融合，构建成重组质粒pFUSE-CHIG-HG1和pFUSE2-CLIg-HK。从杂交瘤克隆的cDNA中扩增出可变区的DNA片段，并测定其序列。图1B显示了每个VH和VL的互补决定区(CDR)。两株鼠单抗的VH和VL序列均有四个框区(FRS)和三个CDR，与V基因和J基因的开放阅读框序列高度保守(图1B)。根据这些序列，我们为每个单抗设计了新的引物，并构建了表达质粒(表1和图1C)。

图1构建的KH-1和OHV-3嵌合形式  (A)抗体嵌合形式的模型。重链和轻链的恒定区域显示为阴影矩形，而可变区域显示为填充矩形。(B)单抗KH-1和OHV-3可变区的氨基酸序列。重链(VH)和轻链(VL)的可变区的互补决定区(CDR)序列用阴影表示。(C)表达载体的构建。将重链和轻链的V结构域序列插入到包含各自恒定结构域的载体中。

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2、纯化嵌合单抗的制备:
将构建的重链和轻链重组质粒共转染HEK293T细胞，每个嵌合单抗均表达。用Protein A树脂进行纯化。用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色对纯化的嵌合单抗进行分析(图2)。检测到嵌合单抗KH-1和OHV-3的重链(约50 kDa)和轻链(约25 kDa)条带，表明嵌合单抗的制备成功。

图2纯化的嵌合单抗。用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色对纯化的嵌合KH-1和OHV-3进行分析。将重链和轻链表达质粒共转染HEK293T细胞，制备了两株嵌合单抗KH-1和OHV-3。4天后，收集上清液。用rProtein A琼脂糖凝胶纯化嵌合抗体。

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3、IFA证实嵌合单抗与原始单抗识别相同的抗原
为了证实嵌合单抗与原始单抗识别相同的抗原，进行了间接免疫荧光试验(IFA)。用gQ1和Gh表达质粒分别转染HEK293T细胞。两天后，用嵌合单抗和鼠单抗检测其表达。如图3A所示，gQ1或Gh可通过嵌合的KH-1或OHV-1单抗以及小鼠KH-1或OHV-1单抗被检测到。嵌合单抗和鼠单抗均可检测到HHV-6B感染的MT4细胞。这些结果表明，嵌合单抗具有较强的抗原识别能力。

图3 抗原的识别作用。(A)将空质粒或表达gQ1或Gh的质粒转染HEK293T细胞，2天后用鼠源单抗或嵌合单抗(绿色)与Hoechst 33258(蓝色)染色。(B)感染HHV-6B株(HST株)的MT4细胞和模拟感染的MT4细胞在感染后3天分别用嵌合单抗(绿色)和Hoechst 33258(蓝色)进行染色。

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4、嵌合单抗的中和活性
为了鉴定嵌合单抗的中和活性，进行了病毒中和试验。我们首先将纯化的嵌合单抗或原始鼠单抗按4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.1和0.05ug/ml的浓度与HHV-6B混合后依次配制成稀释液。孵育后，每种混合液分别用于MT4细胞的感染。用抗HHV-6B即刻早期蛋白1(IE1)的兔抗血清在感染后3天(Dpi)进行间接免疫荧光试验(IFAS)。结果表明，嵌合单抗KH-1以浓度依赖的方式抑制HHV-6B感染。当该单抗浓度为4.0ug/ml时，未检测到IE1阳性细胞，表明可完全抑制感染(图4A和图B)，这种中和活性与最初的鼠单抗相同(图4B)。另一方面，嵌合OHV-3或其原始单抗在4.0ug/ml时，观察到IE1表达水平，表明OHV-3在此浓度下的中和活性非常弱或不存在(图4C)。由于OHV-3单抗的中和活性是在先前的研究(文献[1])中直接用小鼠腹水稀释液检测的，因此需要研究提高的OHV-3的有效浓度。因此，我们制备了较高浓度的100、50、25、12、6、3、1.5ug/ml的OHV-3，如图4D所示，嵌合和小鼠OHV-3单抗均以浓度依赖的方式中和感染，在100ug/ml就能完全抑制HHV-6B感染。

图4免疫荧光染色分析嵌合抗体的中和活性。MT4细胞要么不处理，要么用指示抗体的连续稀释用离心法预先孵育，然后用HHV-6B(HST株)原种(3.2×104TCID50/ml)感染MT4细胞，然后用HHV-6B(HST株)菌种(3.2×104TCID50/ml)感染MT4细胞。剩余抗体洗去后，细胞培养3d。用兔抗即刻早期蛋白1抗血清(绿色)和Hoechst 33258染色细胞核(蓝色)检测HHV-6B感染。(A)HHV-6B感染或模拟感染细胞的结果，无中和单抗。(B)KH-1代表性显微照相。(C、D)使用低浓度(4.0ug/ml)和高浓度(高达100ug/ml)OHV-3进行中和的结果。

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5、WB证实嵌合单抗的中和活性
为了进一步证实嵌合单抗的中和活性。用兔抗IE1血清和抗HHV-6B被膜蛋白U14的单抗免疫印迹检测感染MT4细胞的病毒蛋白。与IFA结果一致，当嵌合KH-1浓度为4.0g/ml或嵌合OHV-3浓度为100g/ml时，均未检测到IE1和U14(图5)。这些结果表明，新设计的嵌合单抗能有效地中和HHV-6B感染。

图5免疫印迹法检测嵌合抗体的中和活性。将MT4细胞与小鼠或嵌合OHV-3(100或3ug/ml)或小鼠或嵌合KH-1(4.0或0.1ug/ml)预先孵育，然后用HHV-6B(HST株)原种(3.2×104TCID50/ml)感染MT4细胞。洗涤后，细胞培养3d，裂解后进行免疫印迹。用兔抗血清和特异性单抗分别检测HHV-6B即刻早期蛋白1(IE1)和被膜蛋白U14。

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6、嵌合单抗中和活性的定量评价
综上所述，上述结果表明，人源化后这些单抗的中和活性没有明显丧失。为了进一步评估它们的中和活性，我们对IFA结果进行了量化。我们对每个样本中代表感染的IE1阳性细胞和细胞核进行计数，并计算感染率。通过与对照样品的归一化计算了单抗的抑制率，如图6所示。所有单抗都显示出剂量依赖性的中和活性。根据单抗的中和效价和浓度进行四参数Logistic回归，计算出半最大抑菌浓度(IC50)。结果汇总于表2。嵌合KH-1单抗(0.18ug/ml)的IC50与小鼠单抗(0.17ug/ml)的IC50相似。小鼠和嵌合OHV-3的IC50也处于相同水平(分别为7.7和6.9ug/ml)，但均高于KH-1的IC50。

图6 中和效价的测定。本研究中单抗KH-1和OHV-3的抑制率定义为100相对感染率。根据中和试验中使用的感染细胞数和总细胞数来确定相对感染率。绘制了KH-1(A)和OHV-3(B)的抑制率和标准偏差与中和试验中所用单抗浓度的关系曲线。这些数据显示了来自三个独立实验之一的代表性结果。每个点代表三个样本的平均结果，即标准偏差。为了确定显著性，进行了Student-t检验，每个数据集上方都显示了P值。

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讨论：
鼠源性单抗的固有免疫原性可以通过构建鼠-人嵌合单抗来降低，这是一项经典的技术。FDA已经批准了九种嵌合抗体，并在不同的临床领域中使用。在本研究中，我们构建了抗HHV-6B的两株中和单抗的嵌合形式。这些嵌合单抗被发现与各自的原始鼠单抗具有相同水平的中和活性(图4、图5和图6)。KH-1在体外试验中显示出相对较强的中和活性(图6和表2)。因为我们的嵌合抗体是治疗性抗体的候选抗体，还需要在体内进行进一步的评估。然而，目前还没有HHV-6B感染的体内实验模型。因此，建立HHV-6B感染的动物模型是研制针对HHV-6B的治疗性抗体的迫切需要。

这些首批产生的针对HHV-6B的嵌合单抗被认为比相应的小鼠单抗的免疫原性低，半衰期和疗效都有所提高。然而，嵌合单抗在人类受体中并不是完全没有免疫原性问题。为了进一步降低它们对小鼠的免疫原性，可能有必要将原始小鼠单抗的CDR嫁接到人免疫球蛋白FRs上。包膜糖蛋白复合体在疱疹病毒感染中起关键作用。疱疹病毒进入宿主细胞通常被描述为级联。对于HHV-6B，Gh/g1/gQ1/gQ2复合体与其细胞受体CD134的结合可能激活了糖蛋白B(GB)的功能。疱疹病毒的保守融合原gB和Gh在进入病毒的过程中协同调节病毒被膜和细胞膜之间的融合。每个单抗的不同结合域可能在病毒进入的每一步发挥不同的作用。结合亲和力也是描述单抗中和活性的一个重要因素。在本研究中，我们发现OHV-3的中和活性弱于KH-1。原因可能是KH-1识别gQ1，而gQ1直接与CD134结合。KH-1与Gh/g1/gQ1/gQ2复合物的gQ1直接结合可能干扰gQ1与CD134的相互作用，因为与KH-1未识别的gQ1突变体的四聚体复合物不能与CD134结合(图7A)。识别Gh的OHV-3可能对进入步骤有不同的影响，例如抑制Gh的融合活性或抑制Gh与Gb的协作结合(图7b)。由于这两种单抗都不能用于Western blotting，所以每一种单抗都被认为能够识别每种蛋白质的构象。单抗所产生的蛋白质可能会影响其进入的功能。要回答这些问题，还需要进一步的研究。

图7的空间位阻--单抗KH-1和OHV-3中和可能机制的模型。对于HHV-6B的进入，Gh/g1/gQ1/gQ2糖蛋白复合体，特别是gQ1，直接与细胞受体CD134结合。(A)与gQ1相互作用的KH-1可直接抑制受体结合。(B)Gh与OHV-3的相互作用可能影响Gh的功能(与Gb融合或结合)，从而抑制病毒侵入。