噬菌体抗体库技术--噬菌体抗体库固相筛选实验

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噬菌体抗体库技术--噬菌体抗体库固相筛选实验

噬菌体展示技术(Phage Display Technique，PDT)是将编码外源多肽或蛋白的基因片段插入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在读码框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，外源多肽或蛋白能与外壳蛋白融合表达。融合蛋白展示在噬菌体颗粒的表面，而编码该融合子的DNA则位于噬菌体颗粒内，这样使得多肽或蛋白与其DNA编码序列之间、表型与基因型之间建立了直接联系。

噬菌体展示技术中被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，可以作为一项筛选技术，用固相化的抗原与噬菌体抗体库孵育，通过数次“吸附-洗涤-洗脱-扩增”过程，每一轮的筛选大约可以使特异性噬菌体得到100-1000倍的富集，最终使特异的噬菌体得到上千倍乃至10^9的富集，使各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）通过淘选得以快速鉴定。

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所需实验耗材：

① 冻存的抗体库甘油菌、辅助噬菌体（如：M13K07）、超级辅助噬菌体，TG1菌划板生长不超过一周的平皿。

② 96孔F底酶标板，U型底细胞板，96孔深孔板，离心瓶，离心管，三角瓶等。

③ 仪器：洗板机，台式震荡仪，摇床，孵箱，离心机，酶联仪等。

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（二）、试剂配制：

① 20%葡萄糖：20g葡萄糖加去离子水，定容至100ml，过滤除菌，常温下可保存数月。

② 1×PBS(pH=7.4)：用800ml蒸馏水溶解8g Nacl，0.2gKcl，1.44g磷酸氢二钠，0.24g 磷酸二氢钾。用Hcl调节溶液的pH，定容至1L，高压灭菌，室温保存。

③ 20%PEG/2.5M NaCl溶液：200gPEG6000，146.25g Nacl溶于水中，定容至1L，高压灭菌。

④ 包被液，0.05M 碳酸盐缓冲液（pH=9.6）：碳酸钠0.75g，碳酸氢钠1.45g，加双蒸水至500ml。

⑤ 卡那霉素（1000×）：5g卡那霉素加去离子水溶解，定容至100ml，0.22uM过滤器过滤，分装成小份于-20℃贮存。

⑥ 2-YT培养基：在800ml水中加入16g胰蛋白胨，10g酵母提取物，5g氯化钠，搅拌至完全溶化，定容至1L，高压灭菌，4℃保存。

2-YT-GX：2YT+0.4%葡萄糖+X，X为噬菌粒带的抗性，如Cm/Amp等；

2-YT-KX：2YT+50ug/ml卡那霉素+X，X为噬菌粒带的抗性，如Cm/Amp等；

2-YT-KXY：2YT+50ug/ml卡那霉素+X+Y，X为噬菌粒带的抗性，如Cm/Amp等；Y为诱导剂，如阿拉伯糖或者IPTG，由噬菌粒上的操纵子类型决定；

⑦ 洗脱液，0.1M Glycine-Hcl（pH=2.2）：1.5g Glycine(甘氨酸)，用去离子水溶解，Hcl调pH至2.2，加水定容至200ml。

⑧ 中和液，1M Tris-Hcl：12.1g Tris，用去离子水溶解，Hcl调pH至8.0，加水定容至100ml。

注：配制好⑦和⑧后，进行中和滴定，测得每100ul的0.1M 甘氨酸-HCl（pH=2.2）大概需要加20ul的1MTris-Hcl达到中和。

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DAY 1: 抗体库的噬菌体呈现

⭐ 为减少噬菌体污染，进行以下操作时，尽量使用带过滤芯的枪头，一次性耗材。

⭐ 实验中产生的废弃物置于1%次氯酸钠液体中，灭活残存的噬菌体颗粒。

⭐ 实验台，仪器，和玻璃器皿每次使用后用1%次氯酸钠清洗一遍。

⭐ 废液统一收集在耐高压的废液缸中，实验结束后高压废液和废弃物，清除噬菌体，防止污染实验室。

抗体库的噬菌体呈现：

1. 从-80℃取出冻存的抗体库菌液一支，冰上融化，加入到400ml的2YT-GX 培养基中，初始OD值调整到0.1（1OD≈5×10^8），37℃，220rpm摇菌，培养至OD≈0.5；

2. 按MOI≈10的比例加入M13KO7超级辅助噬菌体，约10^12cfu，室温静置30min；

3. 37℃，150rpm继续培养30min，4000rpm离心15min，弃上清，不留残液；

4. 用400ml的2-YT-KXY培养基重悬菌团，28℃，220rpm，培养16-20小时；

5. 菌液准备：从TG1细菌培养平皿中单挑两个菌落，接种到2管5ml的2-YT培养基中，37℃，220rpm，培养过夜；

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DAY 2：

（一）噬菌体抗体库的纯化：

6. 收菌：过夜培养的噬菌体抗体库菌液，4℃，8000rpm离心30min，收集上清，分装到两个500ml的离心瓶中，每瓶约200ml；

7. 在每瓶200ml上清中加入50mlPEG/NaCl溶液，冰浴至少4小时以上；

8. 此时可转接0.5ml过夜培养的TG1细菌到5ml的2-YT培养基中，37℃，220rpm，培养至OD≈0.4，取出立刻冰浴30min，然后放置于4°C，可供当天使用；

9. 取出步骤7.中冰浴好的离心瓶，4℃，8000rpm离心60min，弃上清，保留沉淀，各取1ml冰预冷的PBS重悬两个离心瓶中的白色噬菌体沉淀，转移到2个1.5ml灭菌离心管中；

10. 4℃，12000rpm离心10min，收集上清转移到新的1.5ml灭菌离心管中，弃细菌残渣；

11. 在1ml的上清液中加入250ul的PEG/NaCl溶液，冰浴至少1小时，4℃，12000rpm离心20min，充分弃上清，不留残液；

12. 各取0.5ml冰预冷的PBS重悬两个1.5ml离心管中的白色噬菌体沉淀，合并后4℃放置，取出合适的量用于抗体的筛选，余下包装好的噬菌体抗体库加入甘油至终浓度为20%，-80℃冻存；

（二）噬菌体抗体库的滴度测定：

13. 将新制的噬菌体抗体库用PBS进行10倍等比稀释，取-8到-11稀释度的液体各10ul，感染200ul当天制备的TG1细菌（OD≈0.4），37℃，静置感染30min，然后37℃，150rpm培养30分钟；

14. 将感染后的TG1涂布在2-YT-GX固体平皿上，37℃倒置培养过夜，次日计数菌落数，计算抗体库滴度；

（三）一筛准备：

15. 抗原包被: 一轮筛选抗原用量约1.5-3ug/孔，用包被液稀释抗原浓度至10-15ng/ul，每孔150ul，设置每组4个复孔，4℃包被过夜，酶联板用封口膜封住，可以保留一周，不影响使用；

16. 菌液准备：从TG1细菌培养平皿中单挑两个菌落，接种到2管5ml的2-YT培养基中，37℃，220rpm，培养过夜；

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一轮筛选：

17. 新鲜配制PBST，封闭液：

PBST：1×PBS+0.1% Tween-20

封闭液：50ml的PBST中加入1g脱脂奶粉

18. 抗原封闭：弃去酶联板中包被液体，洗板机上用PBST洗涤6次；纸巾上拍干孔内残余液体，每孔加入200uL封闭液，常温下封闭2h；

19. 封闭结束后，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，400rpm，每次3min；

20. 用封闭液将噬菌体库滴度调整到5×10^11/ml，酶标板每孔加入200ul抗体库。室温下放置2h，再以200rpm低速摇动，结合20min；

21. 此时可转接0.5ml过夜培养的TG1细菌到5ml的2-YT培养基中，37℃，220rpm，培养至OD≈0.4，取出立刻冰浴30min，然后放置于4°C，供当天使用；

22. 洗涤：用PBST洗涤10次，再用PBS洗涤10次，400rpm，每次3min。PBST洗涤时，每完成2次洗涤，Tween-20浓度增加0.1%；

23. 洗脱：洗涤完成后，各孔加入150ul洗脱液，400rpm，室温震荡洗脱20min。将目的抗原孔和对照孔中的洗脱液取出，分组合并，各600ul，加入120ul 中和液进行中和，混匀，于冰箱4℃放置；

24. 按照每孔200uL的量，将TG1菌液（OD≈0.4）加入到酶标板洗脱后的样品孔和对照孔中，室温下静置感染30min，然后37℃，150rpm培养30分钟；
25. 洗脱噬菌体的感染：取TG1菌液（OD≈0.4），按照3.5ml菌液/管，分装到试管中，分别加入步骤23.中各组洗脱液以及对照组洗脱液，总体积为4.2ml左右。室温下静置感染30min，然后37℃，150rpm培养30分钟；

26. 计数和放大培养：将酶标板和试管中的菌液合并收集在一起，总体积为5ml左右。准备出一些装有450ul的2-YT培养基的1.5ml离心管，从实验和对照组各取50ul菌液加入培养基中，继续10倍稀释3个梯度，取-2到-4稀释度的液体各250ul的菌液，涂布于2-YT-GX平皿，37℃倒置培养过夜，次日计数菌落数，计算产出率；

27. 将实验组的剩余菌液离心，4000rpm离心10min，留1ml上清液将菌落悬起，涂布于1个2-YT-GX大方形平皿中，37℃倒置培养过夜；

phoenix_eagle

加油加油。还有几轮的实验Protocol没有粘贴好。加油。