ELP30-tag蛋白纯化能力的原核表达研究

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摘  要　
目的：探究一种小分子量类弹性蛋白标签(ELP30 tag)在原核表达系统中的蛋白纯化能力。
方法：人工合成ELP30-tag基因并将其构建于pET-28a(+)载体，结合2种内含肽基因和增强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因，构建４个含有不同元件序列的原核表达载体：pET-ELP30、pET-ELP30-eGFP、pET-ELP30- intein1- eGFP、pET -eGFP-intein2-ELP30；将表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导重组蛋白表达，并通过可逆相变循环纯化重组蛋白ELP30、ELP30-eGFP、ELP30- intein1- eGFP、eGFP-intein2-ELP30；随后通过调节溶液pH值或添加二硫苏糖醇（DTT）分别诱导intein1和intein2断裂，最后再经可逆相变循环分离获得纯
eGFP。
结果：利用设计的ELP30-tag成功纯化获得了重组蛋白ELP30、ELP30-eGFP、eGFP-intein2-ELP30（实际纯化出来三个，缺ELP30-intein1-eGFP）；重组蛋白ELP30-intein1-eGFP、eGFP-intein2-ELP30中的内含肽可经诱导发生断裂而释放eGFP，但未能分离获得纯eGFP。
结论：为小分子量ELP30-tag的运用和优化设计奠定了一定基础。

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背 景 资 料
类弹性蛋白(elastin likeprotein ELP)是一种温度敏感性多肽。
在水溶液中，ELP低温可溶，当溶液升温并超过ELP的相变温度(Transition temperature,Tt)后，ELP分子构象变化，疏水聚集，迅速从溶液中析出；溶液降温（T<Tt）后，ELP分子可恢复为溶解状态。        
ELP的这一性质被称为可逆相变（inversetransition），多数ELP重组蛋白都具有这一特性，并且能通过可逆相变循环（inverse transition cycling,ITC）进行纯化：
将具有自切割功能的内含肽（intein）和ELP联合使用，构成ELP intein标签（EI tag），带有EI tag的重组蛋白可先通过ITC纯化，再诱导intein断裂，释放与EI tag融合表达的目的蛋白，最后通过ITC去除EI tag，获得目的蛋白。
相比于HIS等常用的蛋白纯化标签，EI tag蛋白纯化体系无需树脂基质，成本低廉，操作简单且易于放大，商业化前景良好。
ELP较为常用的类型是（Val Pro Gly Xaa Gly）n
ｎ代表重复数，可以设计为30-90不等。Xaa代表除Pro外的任意氨基酸。以Val、Ala、Gly替代Xaa，三种氨基酸比例为5：2：3（Xaa=V5A2G3）设计出一系列长度不等的ELP tag。ELP的Tt值随ｎ值增大而降低。

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主 要 实 验 材 料　
大肠杆菌Trans1 T1和BL21(DE3)。
质粒pET-28a（+），原核表达载体。
NEB公司的pTWIN1（带有两段不同内含肽基因）

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第一步：

改构NOVAGEN商品化载体pET-28a，在原载体pET-28a上改构一个新的多克隆位点。

F1为上游引物，R1为下游引物

以pET-28a为模板，扩增出一个338bp的DNA片段，

ACATGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAATGGTCGACGGTACCGCATGCGGATCCCTCGAGCGG

XhoI/Sph I双酶切处理载体pET-28a和PCR产物。

连接，转化，挑克隆，鉴定，测序。

得到改造后质粒pET-28a’

通过在引物R1的 5′端加入多个连续酶切位点，在新质粒pET-28a′中引入新的多克隆位点（MCS）：Sal I-Kpn I -Sph I–BamH I-Xho I

引物R1这样设计，存在一个很麻烦的问题，因为引物R1和引物F1中都有一个Sph I酶切位点，这样以来，338bp的PCR产物在被Xho I/Sph I双酶切时。

如果酶切完全，得到①和②片段

如果酶切不完全，得到①，②和③片段。

③片段是改造载体过程中期望得到的片段，所以只能不完全酶切才能将这段DNA引入到pET-28a中。

这个工作非常耗精力，并且载体中多引入一个Sph I酶切位点，为后续的重组质粒鉴定带来麻烦。

改造后的pET-28a′质粒电子克隆序列见附件。

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① 构建pET-ELP30

在改造后的pET-28a′的基础上，开始构建四种原核表达载体。

利用Xho I/Kpn I将ELP30片段（450bp），定向克隆插入到pET-28a′中。

② 构建pET-ELP30-eGFP

eGFP-F1为上游引物，eGFP-R1为下游引物

以pSL-elp30-intein1-EGFP为模板，扩增出一个720bp的EGFP片段。

GGGGTACCAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGATCCCG

利用BamHI/Kpn I将扩增出的EGFP片段，定向克隆插入到pET-ELP30中。

扩增EGFP的上游引物上为什么要添加10个天冬酰胺? 没想明白，求指点。

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③ 构建pET-ELP30-INTEIN1-EGFP
利用BamH I/ Xho I将pSL-elp30-intein1-EGFP质粒中的ELP30-INTEIN1-EGFP片段（450+462+720bp）定向克隆插入到pET-28a′中。
④ 构建pET-eGFP-intein2-ELP30
文中的引物EGFP-R2和INTEIN2-F序列正好写反了。
EGFP-INTEIN2-ELP30扩增产物：
GCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGCATCACGGGAGATGCACTAGTTGCCCTACCCGAGGGCGAGTCGGTACGCATCGCCGACATCGTGCCGGGTGCGCGGCCCAACAGTGACAACGCCATCGACCTGAAAGTCCTTGACCGGCATGGCAATCCCGTGCTCGCCGACCGGCTGTTCCACTCCGGCGAGCATCCGGTGTACACGGTGCGTACGGTCGAAGGTCTGCGTGTGACGGGCACCGCGAACCACCCGTTGTTGTGTTTGGTCGACGTCGCCGGGGTGCCGACCCTGCTGTGGAAGCTGATCGACGAAATCAAGCCGGGCGATTACGCGGTGATTCAACGCAGCGCATTCAGCGTCGACTGTGCAGGTTTTGCCCGCGGAAAACCCGAATTTGCGCCCACAACCTACACAGTCGGCGTCCCTGGACTGGTGCGTTTCTTGGAAGCACACCACCGAGACCCGGACGCCCAAGCTATCGCCGACGAGCTGACCGACGGGCGGTTCTACTACGCGAAAGTCGCCAGTGTCACCGACGCCGGCGTGCAGCCGGTGTATAGCCTTCGTGTCGACACGGCAGACCACGCGTTTATCACGAACGGGTTCGTCAGCCACGCTAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACCTCGAG(ELP30)GGTACC
在扩增INTEIN2的下游引物上也添加10个天冬酰胺，不知道是起什么样的作用。

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根据电子克隆可以推测pET-ELP30-intein1-eGFP中存在两个Sph I酶切位点，MCS中的Sph I没有被破坏，所以质粒pET-28a′上，两个Sph I之间的312片段依旧存在。

pET-eGFP-intein2-ELP30质粒MCS中的Xho I和Sph I没有被破坏，所以存在两个Sph I酶切位点和两个Xho I酶切位点，酶切后图谱和文中并不一致。所以回头再看，引物R1设计不合理，在设计时如果不加Sph I酶切位点，实验步骤会简单很多，并且酶切后图谱和文献报道的保持一致。

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根据文献整理出的重组蛋白的诱导表达实验流程（滤膜截留法，适用于带ELP标签的蛋白）：

1.重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),涂布含抗生素的LB平板上，37℃生长10小时，挑取单菌落，加5ml含抗生素的液体LB培养基中，过夜活化。

2.按1：100比例接种至100ml含抗生素的液体LB培养基中，37℃培养至OD=0.6-0.8,加入终浓度0.5mM IPTG,25℃过夜诱导。

3.10000*g，离心2min收集菌体。离心后的菌团用冰预冷的PBS或者Buffer A洗涤，体积为原培养基的1/5，-80℃冻存备用。

Buffer A:20mMTris.cl,500mM Nacl，PH=8.5

4. 将菌液置冰上解冻后加入终浓度１mM PMSF蛋白酶抑制剂，超声（功率200W,破碎1s停3s）至菌液澄清透亮。

5. 16000*g，4℃离心15min，将上清液用0.22μM针式滤膜过滤备用。

6. ITC法进行蛋白纯化，直至目的蛋白的纯度较为理想。

单次的ITC操作如下：

① 向5ml菌体破碎上清中加入Nacl粉末至终浓度4M，吸入注射器中，室温静置５min，观察到明显的浑浊后，过孔径0.22μM针式滤膜截留ELP重组蛋白；

② 注入２ml PBS或者Buffer A（室温，含4mM Nacl）洗涤滤膜，用１ml冰上预冷的PBS或者Buffer A洗脱；

③ 每个样品各进行三次ITC操作，最后一次ITC操作时，以500μL冰上预冷的PBS洗脱。

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图为ELP30和ELP30-eGFP纯化检测结果。结果可见通过HIS纯化的蛋白，WB检测不止一条带，分析质粒序列可以见到在EGFP基因前和ELP30前分别有一个ATG起始密码子，在翻译时很大可能产生两个蛋白，一个为ELP30-EGFP，另一个是EGFP蛋白，因为两个蛋白C端都有HIS标签，所以使用His-Tag都能得到纯化，而用ELP30标签纯化时，只能纯化出ELP30-EGFP,WB检测结果可以看到，HIS纯化后的蛋白除了一条主带被监测到外，还有一条30kd左右的带，和EGFP蛋白大小相符合。

在设计引物eGFP-F1时，如果去掉EGFP基因前的ATG，WB的检测结果可能会更纯一些。