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0008 GST PULL DOWN assay

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发表于 2021-1-18 22:21:45 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 黄帮主 于 2021-2-12 17:15 编辑


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 楼主| 发表于 2021-1-18 22:49:33 | 显示全部楼层
GST(谷胱甘肽巯基转移酶) 蛋白是机体内重要的代谢酶之一,是细胞抗损伤、抗癌变等解毒系统中主要成员,天然大小为26KD。目前GST已成为蛋白表达纯化技术中常用的一个标签蛋白,长度为231aa,使用重组DNA技术将GST蛋白基因插入到目的蛋白基因(X)的C末端或N末端,可实现融合蛋白X-GST/GST-X的高效表达。
以GST作为标签进行融合蛋白表达,原因大致有二:① 它是一个高度可溶的蛋白,希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性;② 它可以在大肠杆菌中大量表达,起到提高表达量的作用。
GST融合蛋白有着很广泛的应用,除了进行蛋白的亲和纯化外,还可以做为诱饵蛋白,进行蛋白质之间相互作用的研究,如,GST pull-down实验,能捕获到与诱饵蛋白组cp的未知靶标蛋白,也可用于鉴定诱饵蛋白和已知的靶标蛋白之间的相互作用。
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 楼主| 发表于 2021-1-18 22:57:43 | 显示全部楼层
在GST pull-down实验中,GST融合蛋白作为一个诱饵蛋白,通过GST标签可以与琼脂糖球珠上的谷胱甘肽(GSH)配基亲和结合。GST融合蛋白与谷胱甘肽琼脂糖珠共同孵育形成固相复合物后,当与诱饵蛋白有相互作用的靶标蛋白再与固相复合物混合时,可被诱饵蛋白捕获住,从而吸附在谷胱甘肽琼脂糖珠上(如上图),SDS-PAGE电泳后,可用免疫印迹、放射自显影甚至染色分析、质谱分析,体外验证蛋白间是否存在直接作用关系。
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 楼主| 发表于 2021-1-18 22:58:16 | 显示全部楼层
GST pull-down实验主要分4步:
① GST-A融合蛋白(诱饵蛋白)的制备
② 靶标蛋白B的制备
③ A-B蛋白的体外结合
④ SDS-PAGE,WB检测/放射自显影/质谱分析
在GST pull-down实验中: “诱饵蛋白”多为原核表达而来,也可通过真核表达获得。
待捕获的“靶标蛋白”可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、体外转录翻译系统等多种方法获得。

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 楼主| 发表于 2021-1-18 22:59:12 | 显示全部楼层
pGEX 系列载体是目前用于构建GST 融合蛋白最常用的原核表达载体。 载体为Amp抗性,pTAC 启动子,受IPTG 诱导表达,还有控制过表达的lacI抑制单元,载体上的GST 标签能够增强下游蛋白的可溶性表达,使融合蛋白易于表达纯化。
pGEX系列载体上的外源基因不需要T7 RNA聚合酶启动蛋白表达,因此转化普通的大肠杆菌,经IPTG诱导即可表达。每100ml的培养菌液,能产生约250ug的GST融合蛋白。
此外,能表达GST融合蛋白的真核表达载体有pEBG-3X等,一些需要翻译后修饰的蛋白,或者在原核中表达容易降解以及容易形成包涵体的蛋白可以尝试用真核表达系统进行GST融合蛋白的表达。


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 楼主| 发表于 2021-1-19 11:10:18 | 显示全部楼层
本帖最后由 黄帮主 于 2021-1-19 11:16 编辑

公司购买的GST-凝胶珠通常保存在20%的乙醇中,使用前拧紧瓶盖,晃动瓶子充分混匀。珠子和GST融合蛋白的结合可以通过凝胶装柱后,将样品低速流过柱体进行,也可以直接将凝胶珠和样品加入离心管中,通过翻转混匀+低速离心完成。
GST凝胶珠子的结合载量>8mg/ml,如果需要结合1mg的GST融合蛋白,通常使用柱床体积为200 μl的谷胱甘肽凝胶4B珠子。





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 楼主| 发表于 2021-1-19 11:29:06 | 显示全部楼层
制备能产生1ml柱床体积的谷胱甘肽凝胶4B珠(50% slurry):
① 将瓶中的GST-4B凝胶珠充分晃动混匀,取1.33ml加入到10-15ml离心管中;
② 4℃,500g离心5min;
③ 小心取出上清并弃去,注意避免搅动到离心管底的凝珠,加入10ml的4℃预冷的PBS,上下翻转,充分混匀;
④ 4℃,500g离心5min;
⑤ 小心取出上清并弃去,加1ml的PBS,充分混匀,制备能产生1个柱体积的50%匀浆(50% slurry)的GST-凝胶珠,放置于4℃,可保存至少一个月。
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 楼主| 发表于 2021-1-19 11:30:53 | 显示全部楼层
主要溶液的配制:
①  PBS buffer (10 × ) :
2.4 g 磷酸二氢钾, 14.1 g 磷酸氢二钠, 2 g氯化钾,80g氯化钠溶解于去离子水中,定容至1L。
使用时稀释成1×PBS,PH值约为7.4。
② 1M IPTG:2.38克IPTG加入到10ml的水中。
③ 1M PMSF:1.74g PMSF,加10mL异丙醇,分装,-20℃冻存。
④ 细菌裂解液:PBS+1%Triton X-100+1mM PMSF。
⑤ 结合缓冲液:50 mM Tris.HCl ,150 mM NaCl ,1 mM EDTA,0.3mM DTT,1mM PMSF。
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 楼主| 发表于 2021-1-19 12:52:43 | 显示全部楼层
表达GST-A融合蛋白:
① 将表达GST-A的原核表达载体转化感受态细菌,涂布平皿(Amp抗性),37℃过夜培养。同时设置对照组,表达只有GST标签的对照蛋白;
② 分别挑取单克隆到含5ml LB(Amp+)培养基的试管里,37℃,220rpm培养6小时以上;
③ 分别取1ml培养菌液转移到装有100ml的LB(Amp+)的三角瓶中,37℃,220rpm培养至OD≈0.8左右(取样1),加入0.4-1mM的IPTG,在适当温度下培养过夜(取样2);
④ 收集菌液,4℃,6000g离心10分钟,收集细菌,去尽上清;
注:如果此时将菌团冻存于-40℃,可长期保存不影响蛋白活性和后续实验。
⑤ 加入10ml的PBS+10ul的1M PMSF,吹打混匀,超声碎菌,300W,超声5s,停5s,至裂解液较为清澈,总用时20-30min;
⑥ 4℃,6000g离心20min,收集上清,0.45μM滤器过滤(取样3),加DTT至终浓度1mM 。
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 楼主| 发表于 2021-1-19 13:03:08 | 显示全部楼层
二、制备GST-A-珠子混合样品
① 取40-50ul的GST-Beads到5ml离心管中,加入过滤好的GST-A细菌裂解液4ml,4℃,翻转孵育3h,对照组GST按照同样方法制备;
② 500g离心5min,弃上清,注意避免搅动到离心管底的凝珠;
③ 用4ml预冷含1% Triton X-100的PBS洗珠子3次,PBS洗珠子3次,每次加入液体后充分混匀,4℃,500g离心5min,弃上清,最后一次留下和珠子等体积的PBS,重悬珠子,制备GST-A-珠子混合液(取样4);
注:混合后的珠子放置于4℃保存,可保存数周;
④  蛋白电泳,比较样品1,2,3,4,判定GST-A的融合表达情况,以及珠子和A蛋白的结合效力。
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