Quantitative Analyses of SMN1 and SMN2 Based on Real-Time LightCycler PCR:

傲慢与偏见

Quantitative Analyses of SMN1 and SMN2 Based on Real-Time LightCycler PCR: Fast and Highly Reliable Carrier Testing and Prediction of Severity of Spinal Muscular Atrophy

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摘要：

目的：脊髓性肌肉萎缩症 (SMA) 是一个由于运动神经元基因SMN1纯合性缺失而导致的常染色体隐性遗传疾病。SMN2和SMA患病严重程度有关，可能是将来SMA疾病体细胞治疗的靶位。

方法：基于实时定量PCR建立一个快速，高效的检测SMN1和SMN2基因的检测实验。

结果：329个携带者和对照检测到SMN1基因，特异性100%，灵敏度96.2%。375名I型，II型，III型的SMA患者能检测到SMN2基因，其拷贝数和SMA型别和生存时间呈相关性，80%的I型患者具有1个或者2个拷贝数的SMN2基因，82%的II型患者具有3拷贝的SMN2基因，96%的III型患者具有3个或者4个拷贝数SMN2基因。在113名I型患者中，9个具有一个拷贝SMN2基因的患者生存时间小于11个月，有2个拷贝SMN2基因的94个患者中，88名存活时间小于21个月，有3个拷贝SMN2基因的10个患者中，8名存活时间在33-66个月。

结论：SMN1纯合性缺失的患者中，结合SMN2的拷贝数，我们可以根据后验性概率推算出患者发病的型别。

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SMA在欧洲是排名第二的常染色体隐性遗传病，发病率为1/6000~1/10,000，携带者频率为1/40~1/50。

SMA是由于脊髓前角细胞运动神经元退变而致的神经肌肉障碍性疾病，引起进行性四肢近端肌肉萎缩，瘫痪，呼吸衰竭，婴儿死亡。根据发病年龄和疾病严重程度，分为三型：

I型(MIM 253300) 6个月前发病，病情最为严重；

II型(MIM 253550) 6 至12 个月发病，病情较为缓和；

III型(MIM 253400)，12 个月后儿童期发病，病情最轻。

SMN 基因位于5q13 区域，位于染色体端粒侧有一个具有生物活性的SMN1基因，另外在着丝粒侧存在一个镜像重复区域SMN2，两个基因具有高度的同源性，二者之间只有 8 个核苷酸的差别，5 个位于内含子中，3 个位于外显子中。在第7和第8外显子分别有两个核苷酸差异，目前用于SMA的诊断。

每个SMA患者至少保留一个SMN2基因，SMN2的拷贝数和SMA病情严重程度呈负相关关系。但是，由于SMN2第7外显子一个核苷酸的突变，导致外显子剪接增强子(exonic splicing enhancer,ESE)遭到破坏，发生外显子的跳读，外显子7丢失而失去功能。在剪接因子Htra2-β1或者药物丁酸钠的作用下，可弥补这一缺陷，而能产生20-30%正常全长转录本，与SMN1 转录本相同，从而补偿 SMN1 基因缺失的功能，使得患者的症状减轻。所以通过上调全长SMN2转录本的产生，预防第7外显子的跳读是基因治疗的一个重要方向。

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携带者样本来源：

通过单倍体分析鉴定的124名携带者，65名有同胞为SMA患者的非携带者，用荧光定量PCR鉴定SMN1拷贝数。

另外，38对SMA携带者健康伴侣，102例无关个人用于鉴定染色体上SMN1上复制的发生率，以及SMA携带者概率。

患者样本来源：

之前已经被鉴定的375名SMA患者，其中188名为I型，110名为II型，77名为III型。

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通过盐析法从血样中提取基因组DNA，溶于TE缓冲液中，准确测量DNA浓度，260 nm:280 nm比值在1.75-1.85之间的样本可以用于荧光定量PCR实验。

样本稀释为20 ng/ul，然后进一步稀释到5 ng/ul。准确的DNA浓度是准确检测基因拷贝数的关键。

C272 (Ag1-CA) 和 C212 是位于SMN基因5‘端的多拷贝多态性标志，进行单倍体分析，也可以用于估计SMN1和SMN2的拷贝数。

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实验方法：
本研究中用到两种方法。

SYBR Green I染料法：通用性好，灵敏度高，只要在普通PCR反应体系中加入荧光染料，稍优化即可，可通过做熔解曲线来分析扩增产物；特异性差，模板起始浓度不同，本底信号也不同，适合进行定性，定量检测。

Hyprobe探针：特异性好，扩增效率高，并且可通过做熔解曲线来分析突变和基因分型，通用性不好，适合定性，定量以及熔解曲线法基因分型。

非特异性染料SYBR Green I法：
设计两套引物用于区分SMN1和SMN2，两者核苷酸的区别分别位于第7外显子的第6位，和第7内含子的214位。

扩增SMN1基因：

telSMNex7forw：5’-TTTATTTTCCTTACAGGGTTTC-3’

telSMNint7rev：5’-GTGAAAGTATGTTTCTTCCACgTA-3’

扩增SMN2基因：

cenSMNex7forw：5‘-TTTATTTTCCTTACAGGGTTTTA-3’

cenSMNint7rev：5‘-GTGAAAGTATGTTTCTTCCACgCA-3’.

Hybprobe探针法：

这种方法是设计两个特异性荧光探针(HybProbe)与目的核酸序列结合，两个探针之间间隔1～4个核苷酸，上游探针的3 ‘端标有供体荧光基团(通常为荧光黄，Fluorescein)，下游探针的5端标有受体荧光基团(通常为LC Red640)。当探针与目标核酸序列结合时，供体荧光基团所激发的能量通过共振能量迁移作用传递给受体荧光基团，后者所释放的荧光信号被荧光检测系统检测。

模板DNA每复制一次就有一个荧光信号被释放，由于所释放的荧光信号与PCR扩增产物成比例增长，因此可以对样本中最初的DNA进行准确定量。

本实验中的两条探针序列为：

SMN FL： 5-AATGCTGGCAGACTTACTCCTTAATTTA fluorescein-3

SMN LC： 5-LightCycler Red 640 AATGTGAGCACCTTCCTTCTTTTTG-3

引物和探针在SMN1基因中的位置如下图

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为检测SMN1基因，选择SMN2纯合缺失，存在两个 Ag1-CA 和C212等位基因 的健康人DNA作为外标，这个样本可以认为含有2拷贝的SMN1基因，分别取1.25, 2.5, 5, and 7.5ng/ml 的DNA样本1.5ul，代表0.5，1，2，3拷贝数的SMN1。

为检测SMN2， 选择SMN1纯合缺失，存在4个Ag1-CA 和C212等位基因 的SMA患者DNA作为外标，这个样本被认为含有2拷贝的SMN2基因。分别取1.25, 2.5, 5, and 10ng/ml的DNA样本1.2ul，代表,1， 2，4，8拷贝数的SMN2。除此之外，还选择5个具有3个或者4个SMN2拷贝数的SMA患者作为标准对照。

备注：SYBR Green I 是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料，只与双链DNA结合才发光，荧光信号与双链DNA分子数成正比，变性时，DNA双链打开无荧光信号，延伸结束时，采集荧光信号。

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本研究中，两种检测方法SYBR Green I染料法和Hyprobe探针，效果相似。

因为SYBR Green I染料法成本更低，因此文章中后续的实验结果都是用这个方法得到：为了验证实验的重复性好，每个反应重复10次，并且分别在10天完成。

SMN1和SMN2基因的扩增曲线如图：a图：四个外标，分别代表0.5，1，2，3拷贝数的SMN1。4个阴性对照，其中3个为SMA患者，无SMN1基因，一个空白水对照。b图：四个外标，分别代表1，2，4，8拷贝数的SMN2。4个阴性对照，其中3个为健康人，SMN2纯合缺失，一个空白水对照。

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选有一个拷贝SMN1基因的携带者和2/3个拷贝SMN1基因的健康人进行SMN1基因的检测。
选有1-4个拷贝SMN2基因的I/II/III型患者进行SMN2基因的检测。
这些检测人群的SMN基因拷贝数之前已经得到多重竞争定量PCR验证过，或者进行过C272 (Ag1-CA) 和 C212的单倍体分析。
其三代家属的SMN基因也做过定量分析。
用我们的方法进行SMN拷贝数的检测，能够区分SMN1/SMN2 1-4个拷贝数的差异，重复性很好，见下表。

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杂合子SMN1的检测
能快速从人群或者有SMA家族史的人群中进行筛选，也能判断复杂杂合子的SMA患者。
图中C为携带者，st为1、2、3拷贝的外标，ctr为对照，定量PCR结果和预期一致。

进一步分析 124名携带者，65名SMA患者的健康同胞（非携带者），140名对照的SMN1拷贝数
结果如下图和表中数据


124名携带者中119名检测为1拷贝SMN1，5名检测为2拷贝。
65名SMA患者的健康同胞（非携带者）中有61名检测为2拷贝SMN1，另4名检测为3拷贝。
说明在这些受试人样本中，有9条染色体中存在两个拷贝SMN1。
为了解更大人群中在单染色体中存在多拷贝SMN1的概率，分析了140名对照，其中有38名携带者的配偶，102名无症状个体。
结果有4人存在1拷贝的SMN1，3人有三拷贝的SMN1，1人有4拷贝的SMN1。
如下图
在单条染色体中存在2个以上拷贝数的比例为2.6%。14/530
530=124+130+4+272