分子克隆中的小实验

黄帮主

双链DNA片段末端加A
纯化后的DNA片段（50-80ng/UL) 15ul
dATP(2.5mM）  2ul
Taq酶缓冲液   2.5ul
25mM 氯化镁  2.5ul
Taq酶  0.5ul
补水  至25ul。
72℃下作用1个小时
反应完全后，不用纯化，直接可以用于和T载体进行连接。

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3'凹端补平

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低熔点琼脂糖凝胶回收DNA
1. 在长波紫外灯下用清洗过的刀片切下含有所需DNA带的凝胶条，置于新的灭菌的1.5 mL Ep管中，加300μLTE。
2、65℃水浴10 min使胶块完全融化。
3、立即加入等体积（300~350 μL）Tris-Cl饱和酚（pH 8.0），摇晃混匀，12000 rpm离心5 min。
4、小心将水相移到另一1.5 mL Eppendorf管中，加入2.5~3倍体积（780 μL即可）预冷无水乙醇。12000 rpm离心5 min。
5、迅速弃上清，一般在管底会有针尖大小的沉淀物，小心用无水乙醇清洗后置于恒温器上干燥（55℃）5~10 min至无乙醇气味，再加入20 μL ddH2O溶解。

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linker的构建：
将两段寡核苷酸序列调整浓度至5uM。
各取1ul，补水至10ul，加入到PCR管中。
95℃冰浴5min。
室温缓解降温至65℃，维持10min。
缓慢降温至室温。

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乙醇沉淀回收DNA大片段：

1.  加入0.1倍体积的乙酸钠（3M，PH=5.2）于DNA溶液中充分混匀，使其最终浓度为0.3M（Na+使DNA的负电荷中和掉）；

2.  加入2.5倍体积用冰预冷的乙醇混合后再次充分混匀

200ulDNA液+20ul 乙酸钠 +500ul无水乙醇

3.  置于-70℃中1小时；

4.  12000rpm离心10分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；

5.  加入800ul 75％乙醇(现配)，12000g离心5分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴

6.  室温下将开盖的EP管的置于实验桌上(超净工作台)以使残留的液体挥发至干

7.  加20-30ulddH2O溶解DNA沉淀，-20℃保存备用。

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原核表达后周质提取：
① 培养后的菌液，4°C， 6000 g 离心15 min；
② 弃上清，用液体（50mM的Tris.CL，pH=8， 0.8% NaCl) 将菌团重悬，混匀；
③ 4°C，6000g离心30 min，弃上清，用0.5 mL蔗糖液体将菌团重悬。
蔗糖液体为(25%蔗糖, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl [pH 8.0])
④ 室温下孵育10min，4°C，6000g离心50 min.
⑤ 收集上清，加入咪唑至终浓度为 0.05%。
⑥ 菌团用0.5ml的冷却的渗透液重悬，6000g离心40min，收集上清；
渗透液体为 (0.5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl [pH 8.0])
⑦ 将⑤和⑥两步得到的上清液混合，进行透析。
透析液为50 mM Tris-HCl ，100 mM NaCl [pH 8.0]

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HRP-标记抗体：① 取5 mL纯化，0.1M碳酸缓冲液(pH 9.3)置换的抗体溶液 (0.7 mg/mL)。
② 将7mg的辣根过氧化物酶(Sigma,St. Louis, MO) 溶解到500 mL 碳酸盐缓冲液中(0.1 M, pH 9.3)。
③ 在②的液体中滴加200ml新鲜配制的钠高碘酸溶液(1.71 mg/mL)，一边滴加一边搅拌，密闭，室温下避光孵育2小时。
④ 抗体液加入到③溶液中，避光，缓慢搅拌4小时。
⑤ 将混合液转到. The procedure was
followed by adding 3 g of sephadex G-25 (Sigma) and incubated for 2 h at room temperature. The column was eluted
with 4 mL of carbohydrate buffer (0.1 M, pH 9.3). Then 0.2 mL
of freshly prepared NaBH4 (5mg/mL in 0.1 mM NaOH) was
added to the eluted solution. After 30 min, 0.4 mL of the NaBH4
solution was added and incubated for 1 h at 4°C. An equal volume of saturated ammonium sulfate solution (pH 8) was
added drop-wise to the above mixture and stirred for 30 min
at 4°C. The mixture was centrifuged for 20 min (6000 g at 4°C),
and the pellet was resuspended in 2 mL TEN buffer (Tris/
EDTA/NaCl buffer [pH 7.2]) and dialyzed against 3 L of same
buffer for 1 day at 4°C.
需要长期保存的话，加入终浓度为20mg/mL的BSA和20%的甘油，4°C保存。

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细胞周质组分的蛋白纯化:
当载体带有 ompT， pelB， CBD 或 DsbA/C信号序列时， 目的蛋白可以被引导入周质空间。 渗透休克是一种从 DE3 溶原菌中准备周质组分的简单方法， 但是，渗透休克的方法对于含有 pLysS 或 pLysE 的宿主菌并不合适， 因为 T7溶菌酶会破坏内膜。
① 重溶细胞沉淀于 30ml 30mM Tris-HCl pH=8 20%的蔗糖中。 加入 60 μl 0.5 M EDTA, pH 8(终浓度为 1mM)。 加入磁力搅拌棒， 室温下缓慢搅拌 10 分钟。
② 10000g，4℃ 离心 10 分钟收集细胞。 去除上清液。
③ 在30ml 的冰冻的 5 mM MgSO4中彻底重溶沉淀， 在冰上缓慢搅拌悬液 10分钟。 此时周质蛋白被释放入缓冲液中。
④ 10000g，4℃ 离心 10 分钟收集细胞。 取1ml 上清液（ 周质组分） 转移入微离心管。 避免混入任何沉淀物。
⑤ 保存剩余的上清液以备活性分析。 保存细胞沉淀物以备进一步的可溶和不溶胞质组分的处理。 记录沉淀的重量。
⑥ 用TCA 沉淀或过滤的方法来浓缩周质组分。 浓缩系数为 10倍。
⑦ 加入等体积的 4× SDS上样缓冲液， 85℃ 迅速加热 3 分钟使蛋白变性。－ 20℃ 保存以备 SDS－PAGE分析。

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TCA沉淀：
① 加入 100μl（ 1/10体积） 的 100％ TCA（ W/V） 至 1ml 培养基中， 振荡 15秒。
② 置于冰上至少 15 分钟。
③ 14000g离心 10 分钟。
④ 去除上清，加入 100μl 丙酮， 混和， 14000g离心 5 分钟洗涤沉淀两次， 从沉淀中去除丙酮。 风干沉淀（ 将管子打开至少 60 分钟， 略微离心）。 剩余丙酮的存在将使重溶变得更加困难。
⑤ 加入 100μl 1× PBS（ 样品浓缩系数为 10） 和 100μl 的 4× SDS上样缓冲液。 通过振荡混和或超声重溶。
⑥ 迅速在 85℃ 加热样品 3分钟使蛋白变性， SDS-PAGE分析之前在-20℃ 保存。

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差示扫描荧光法：用于鉴定纳米抗体的热稳定性。
采用实时荧光PCR仪器进行检测在96-荧光PCR板中，每孔加入25ul终体积的液体。
空白对照孔：2 μL的25×SYPRO橙色染液(Life Technologies) +23 μL的PBS缓冲液(含500 mM NaCl (pH 7.4)).
抗体样品孔：2 μL的25×SYPRO橙色染液(Life Technologies) ＋23ul的抗体液（缓冲液为500mM氯化钠的PBS，浓度调整为0.4mg/ml）
每个样品设置为三孔的复孔。
从5℃开始，每分钟递加0.5℃，直到95℃。
监测各温度各孔的荧光。