Robust quantification of the SMN gene copy number by real-time TaqMan PCR

潇湘妃

Robust quantification of the SMN gene copy number by real-time TaqMan PCR

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摘要：
目的：脊髓性肌肉萎缩症 (SMA) 是一个由于运动神经元基因SMN1纯合性缺失或者突变而导致的常染色体隐性遗传疾病。 所有患者都存在有同源基因SMN2，但是不能代偿SMN1的缺失。SMN2的拷贝数和患者的疾病严重程度负相关，准确检测出SMN2的拷贝数对于临床诊断和预防有重要意义。
方法：建立一个有效的实时定量TaqMan PCR检测技术，对两种样品来源，两种提取方法得到的DNA进行SMN1和SMN2拷贝数的定量检测。
结果：对于SMN1基因，通过加入一条等位基因特异性的上游引物即可获得等位基因特异性扩增。对于SMN2基因，除了等位基因特异性的上游引物，再加入一条SMN1的阻断剂寡核苷酸能有效减少对SMN1非特异性扩增。进一步验证实时定量TaqMan PCR检测技术的有效性，对于所有的基因拷贝数检测，变异系数低于10%。用该定量检测技术检测来源于SMA患者纤维细胞样本，显示SMN1缺失，SMN2拷贝数和疾病严重程度呈现负相关。

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背景

SMA是由于脊髓前角细胞运动神经元受损而致的神经肌肉障碍性疾病，发病率有1/10000，携带者频率为1/50。

SMA是常染色体隐性遗传病，所以未患病的父母一定是双方都为携带者，子女患病的概率为1/4。

临床上，SMA分为3型，I型又称为Werdnig–Hoffmann病，最为严重，无法保持坐姿，抬不起头。II型能独自坐。III型能独自站立，行走，但是有可能在成长过程中渐行失去行走能力。

SMA患者是由于SMN1纯合缺失所致，SMN2基因和SMN1基因有99%的同源性， 所有患者都存在有SMN2基因，但是它不能完全代偿SMN1的缺失。

SMN2和SMN1只存在几个核苷酸的差异，在第7外显子的C-T突变导致外显子跳跃，产生的SMN2缺少第7外显子，这种截断蛋白生物性状不稳定，体外很快降解。临床研究和动物实验显示SMN2的拷贝数和患者的疾病严重程度负相关，SMN2基因只有1-2拷贝数的患者病情严重，3个或者更多拷贝数的患者病情有所缓和，更多拷贝数的患者可能产生完整的蛋白，症状更轻。

阿克拉霉素、丁酸钠和丙戊酸等能促进全长SMN2转录子的产生，可以用于SMA的治疗。
准确检测出SMN2的拷贝数对于临床诊断和预防有重要意义。SMA的基因诊断传统方法为PCR-RFLP分析，能确定SMN1的缺失，但是不能估计SMN基因的拷贝数。

实时定量PCR的方法能分析SMN基因的拷贝数，本研究建立了一个高效的实时定量PCR方法，能有效进行等位基因特异性的扩增，并且对样本来源和DNA的提取方法要求降低，可以分析不同方法，不同样本来源，不同实验室来源的样品。

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样本来源

① 皮肤活体组织，原代培养为人成纤维细胞系，放大规模培养，用DNeasy Tissue kit (Qiagen, Los Angeles, CA)提取DNA。

② 用Puregene D-5500 DNA isolation kit血液提取DNA

NanoDrop测DNA含量， 260/230比值要大于2， 260/280比值大于1.85。

外标： 含1/2个拷贝SMN1 的基因组，含0，2，3个拷贝SMN2的基因组。

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引物，探针，阻断剂寡核苷酸：

用于SMN1检测：

SMN1-ex7F-3g TTCCTTTATTTTCCTTACAGGGTgTC

（为提高等位基因特异性检测，在3‘端倒数第三位引入一个T-G的突变）

SMN-ex7R GCTGGCAGACTTACTCCTTAATTTAA

SMN probe FAM-ACCAAATCAAAAAGAAGGAAGGTGCTCACA-MGBNFQ

（此处红色标记的C应该是A，后续文章补发更正）

SMN2 blocker ATTTTCCTTACAGGGTTTTAGACAAAATCAAAA-PO4

blocker和各自对应的基因上游引物以及探针序列有部分重叠，从而封闭了非特异性扩增。

用于SMN2检测：

SMN2-ex7F-3g TTCCTTTATTTCCTTACAGGGTgTT

（此处红色标记的末尾碱基，即和SMN1的区别所在，在SMN1第7外显子的第6位）

SMN-ex7R GCTGGCAGACTTACTCCTTAATTTAA

SMN probe FAM-ACCAAATCAAAAAGAAGGAAGGTGCTCACA-MGBNFQ

SMN1 blocker ATTTTCCTTACAGGGTTTCAGACAAAATCAAAA-PO4

用于CTFR检测（看家基因）：

CFTR-F TAGGAAGTCACCAAAGCAGTACAGC

CFTR-R AGCTATTCTCATCTGCATTCCAATG

CFTR probe VIC-TATGACCCGGATAACAAGGAGGAACGCTC-MGBNFQ

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扩增的基因序列如图所示：
CFTR序列

SMN1序列

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PCR反应体系为15 μl，包括：
25 ng基因组DNA
1× TaqMan Universal PCR master mix (Applied Biosystems)
300 nM SMN1引物/450 nM SMN2或者CFTR引物
650 nM SMN1阻断寡核苷酸（用于SMN2基因的检测）
500 nM SMN2阻断寡核苷酸（用于SMN1基因的检测，后续结果证实对于等位基因特异性扩增并没有太大效果）
250 nM  SMN/CFTR探针.
PCR仪器选用7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems)
反应条件:
50°C 2 min
95°C 10 min
95°C 15 s, 60°C 1 min（45个循环）
CFTR作为内对照，同样的反应条件下，在不同的PCR管中进行同步反应。
每个反应设3个复孔，每个样品做6次单独的实验。用已知SMN拷贝数的基因组DNA作为外标，这些标准品均含有2个拷贝数的看家基因CFTR。
ES1(1个拷贝的SMN1），ES2(2个拷贝的SMN1），ES3(0个拷贝的SMN2），ES4(2个拷贝的SMN2），ES5(3个拷贝的SMN3）.此外，IS1样本来自III型SMA患者纤维细胞（含有一个突变型SMN1和一个拷贝SMN2）
IS2样本来自血液样本，含有两个拷贝的SMN1和两个拷贝的SMN2基因。
每次实验，在扩增未知样本的同时扩增看家基因，外标作为对照，准确确定待测基因拷贝数

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建立检测SMN1和SMN2拷贝数的等位基因特异性扩增

参考之前的实验结果，可知仅凭借SMN1和SMN2上游引物的3‘末端核苷酸的差异（针对第7外显子第6位），不足以获得等位基因特异性扩增，在原来实验的基础下进行改进，①在3‘端倒数第三位引入一个T-G的错配突变；② 反应中加入阻断剂寡核苷酸。

在SMN1拷贝数检测实验中，有2拷贝SMN1的DNA样本其CT值为26.72±0.04，无SMN1，有2拷贝SMN2基因的患者样本其CT值为41.10±0.41，说明引物中引入错配突变几乎消除了对SMN2基因的非特异性扩增。两者CT值差为14.38，表明对SMN1的特异性扩增和SMN2的非特异性扩增效率能差近10000倍。加入SMN2blocker，检测SMN2基因的患者样本其CT值为41.69±0.82，两者CT值差为0.59，说明加入blocker对于提高SMN1基因的特异性扩增没有太大意义，所以后续实验中不用再加blocker

在SMN2拷贝数检测实验中，检测有2拷贝数SMN2的DNA样本其CT值为27.83±0.14，2个拷贝数SMN1基因的样本其CT值为38.42±0.55，说明改进后的引物虽然显著降低，但是不足以完全消除对SMN1的非特异性扩增。两者CT值差为10.59，表明对SMN2的特异性扩增和SMN1的非特异性扩增效率差近1000倍。加入SMN1 blocker，检测SMN1基因的样本其CT值为40.00±1.17 ，和未加blocker之间的ΔCT = 1.58，对SMN1的非特异性扩增有5倍差异，说明加入SMN1blocker对于消除SMN1基因的非特异性扩增有意义，该反应体系适合对SMN2拷贝数的检测，后续实验中除了加入上下游引物，探针外还需要加SMN1 blocker。

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相对定量法计算SMN1, SMN2，CFTR拷贝数，用 ddCT法进行数据分析，采用这种方法的前提是目标序列和内标序列的扩增效率要接近100%，且两者偏差在5%以内。首先通过斜率法计算SMN和CFTR的扩增效率，绘制标准曲线，确保扩增效率至少达到99%。

程序设置为相对定量检测，以SMN1或者SMN2作为目标基因，CFTR作为内参基因，用Sequence Detection Software SDS 2.2(AppliedBiosystems)软件进行数据分析，SMN的数据以CFTR作为标准，同时以ES，IS等样本作为校准品。如果以2拷贝的基因作校准，那么检测0拷贝的基因理论比值为0，1拷贝的为0.5，2拷贝的为1，3拷贝为1.5。

通常在进行基因拷贝数检测时需要复管检测，通过变异系数（变异系数=标准差/平均数）衡量实验结果的有效性。在本研究中，每个样品至少设置3个复孔，每次实验至少重复六次。

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建立针对SMN1和SMN2的等位基因特异性扩增方法后，用ES1，ES2，ES3，ES4，ES5样本以及IS1，IS2样本来验证，和预期一致。

（这个图和表看得不是很明白，subject 1-6 1-10没找到在哪里有具体描述）