人天然Fab段噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

潇湘妃

人天然Fab段噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

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摘要笔记：
目的：构建人天然Fab段噬菌体抗体库，建立人源抗体制备技术平台，为恶性肿瘤的免疫治疗提供新方法。
方法：从一个健康献血员取200ml新鲜血液，分离淋巴细胞，提取总RNA，逆转录合成cDNA，PCR扩增抗体轻链和重链Fd段cDNA，依次将PCR产物插入载体pComb3相应位点，电穿孔转化感受态大肠杆菌XLl-Blue，加入辅助噬菌体VCSM13产生噬菌体抗体库，酶切和PCR鉴定有无插入片段，用白蛋白和IL-2作为抗原进行筛选富集。
结果：部分重链Fd片段、部分K轻链和x轻链cDNA得到扩增。库容达约1.2×10^6，酶切和PCR显示有插入片段。用不同蛋白进行几轮筛选，抗体库得到了不同程度的富集。
结论：本研究构建的人天然Fab段噬菌体抗体库可为进一步筛选特异性抗体，用于免疫治疗打下基础。

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背景笔记：
噬菌体抗体是指抗体或抗体片段(Fab、Fv或scFv)基因通过与噬菌体衣壳蛋白基因连接，以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的抗体分子。
用B淋巴细胞全套抗体可变区基因克隆并组装成的噬菌体群体称为噬菌体抗体库。
本文从正常人外周血淋巴细胞中构建了一个天然Fab段噬菌体抗体库，为从肿瘤组织中提取肿瘤抗原，用于免疫治疗做准备。

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实验材料：
RNA提取纯化试剂TRIzol，M-MLV逆转录酶SuperScript II，
限制性内切酶Spe I，Xho I，Sac I，Xba I
Oligo dT（12）
XL1一Blue
噬粒载体pComb3，组装Fd段的双酶切位点是Xho I和Spe I，组装轻链的是Sac I和Xba I。
辅助噬菌体VCSM13

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PCR引物，和其他文章中用到的引物比较一致。
http://www.soberreading.com/forum.php?mod=viewthread&tid=23

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其他文献中用到的引物比本文中用到的引物要更多些，覆盖面更广。另外血液来源，本文中只来自一个健康人血液，多样性不如多人采血混合后构建库，库容量和其他文章差了10倍。

① K轻链可变区5’端引物：

Vk1a：5'-GACATCGAGCTCACCCAGTCTCCA-3’

Vk2a：5'-GATATTGAGCTCACTCAGTCTCCA-3’

Vk3a：5'-GAAATTGAGCTCACGCAGTCTCCA-3’

② K轻链恒定区3’端引物：

Ck1d：5'-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGAACTCAG-3’

③ λ轻链可变区5’端引物：

VL1：5'-AATTTTGAGCTCACTCAGCCCCAC-3’

VL2: 5'-TCTGCCGAGCTCCAGCCTGCCTCCGTG-3’

VL3：5'-TCTGTGGAGCTCCAGCCGCCCTCAGTG-3’

④ λ轻链恒定区3’端引物：

Cλ2：5'-CGCCGTCTAGAATTATGAACATTCTGTAGG-3’

分别扩增出K链和λ链，长680bp，通过Sac I和Xba I将两种片段插入到质粒pComb3 中，构建轻链库。

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(1)重链可变区5’端引物：(Xho I：CTCGAG）

VHla：5'-CAGGTGCAGCTCGAGCAGTCTGGG-3’

VHlf：5'-CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGGG-3’

VH3f：5'-GAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGGG-3’

(2)重链恒定区3’端引物（Spe I ：ACTAGT)：

CG1z：5'-GCATGTACTAGTTTTGTCACAAGATTTGGG-3’

CG2a：5'-CTCGACACTAGTTTTGCGCTCAACTGTCTT-3’

CM1：5'-GCTCACACTAGTAGGCAGCTCAGCAATCAC-3’

混合引物，进行PCR扩增，得到680bp左右的条带。

通过Spe I 和Xho I插入到轻链库中，构建Fab库。

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Fab库通过酶切鉴定（注：太早的文献，文中未见有测序，正确率和多样性无法判断），计算库容量为1.7×10^6。用辅助噬菌体感染后，得到相应的噬菌体抗体库。
用IL-2，白蛋白作为抗原进行筛选，三轮筛选后，洗脱下来的噬菌体有增加趋势。

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此外，作者博士论文中用抗原gp96也进行了筛选。
再后续鉴定未见报道。

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讨论部分笔记；
人源性噬菌体抗体库计数的优点在于：
(1) 建一个抗体库，可用于多种不同抗原；
(2) 可得到人源抗体；
(3) 可得到针对自身抗原、非免疫原性的或毒性物质的抗体；
(4) 抗体产生用2～4轮淘选，仅需两周左右的时间；
(5)当抗体库容量很大时，可得到高亲和力抗体。
一般认为，特异性抗体分子达到1×10^7时就能识别全部抗原决定簇的99%，因此构建一个库容为1×10^8的组合噬菌体抗体库，理论上讲基本包括了人体所有的抗体分子。