胶体金免疫层析试纸快速检测技术

黄帮主

胶体金技术基本原理：
以胶体金为示踪标志物应用于抗原抗体结合检测的一项标记技术。
广泛应用于医学，分子学，生物学和免疫学各个学科。
在维生素C，鞣酸等还原剂的作用下，将氯金酸聚合成特定大小的颗粒，这些颗粒在静电作用下形成稳定的疏水胶体状物质，带有负电荷，和蛋白质带有正电荷的集团结合。
胶体金技术基本原理：
把微孔滤膜作为载体，包被已知的抗原或抗体，滴入的待检测样品经微孔膜的渗滤作用或者毛细管虹吸作用，样品中的抗原或者抗体与微孔滤膜包被的抗体或抗原结合，再通过胶体金标记物反应形成红色的线或点，肉眼可见。

黄帮主

1857 年法拉第用还原的方法从 HAuCl 溶液制备胶体金，发现在其中加少量电解质后，可使它由红色变成蓝色 ，终至凝集(自凝) 为无色 ;而加明胶或其他大分子物质后便可阻止这种变化。他的重大发现奠定了胶体金制备和应用的科学基础
1971 年 Faulk 和 Taytor 将胶体金引人免疫化学，此后免疫胶体金技术作为新的免疫学方法，目前在卫生检验中的应用主要是免疫层析法和快速免疫金渗滤法。

黄帮主

胶体金的制备
做为免疫标记探针，制备的胶体金粒子直径应在 3-30nm 范围内。
在氯化金（ HAuCl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多
的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。粒子直径每增加一倍，数量减少为原来的 1/8。
以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径 3～16nm 的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。
氯化金极易吸湿，故一般均以小剂量密封保存（ 0.5g 或 1g），因此在配制氯化金溶液时一次配完，暂时不用的可以用 1.5 ml 试管分装为 1 ml 保存（ -20℃）。
各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗，有条件时可硅化处理（ 1％双氯硅烷/氯仿浸泡 1 小时，烘干）。
配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用 0.22 μm 微孔滤膜过滤后使用。
制备好的胶体金保存寿命较长，可 4℃保存 6 个月以上或室温下保存 1-2 个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。
保存较长时间后应进行镜检，如出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期。

黄帮主

HAuCl4 在还原剂的作用下 ,可聚合成一定大小的金颗粒 ,形成带负电的疏水胶溶液。
由于静电作用而成为稳定的胶体状态 ,故称胶体金。
胶体金标记实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。
这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能 ,可以与葡萄球菌A 蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合 ,因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的方法。

黄帮主

金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)胶体金探针制备:
1. 制备和鉴定胶体金
用纯水溶解氯金酸使其终浓度为0.01%，在磁力搅拌器上加热至沸腾；
搅动下，按照每100ml的液体，快速加入1%的柠檬酸三钠水溶液1.8ml；
继续煮沸，待金黄氯金酸水溶液变为稳定的紫红色，大约7-10min，开始冷却；
用0.45um的过滤器过滤并用去离子水定容至原体积；
用透射电镜和紫外-可见光谱仪观察胶体金溶液的分散性，均一度以及金颗粒粒径；
制备的胶体金溶液，4℃避光保存。

黄帮主

2. 胶体金的标记条件--最适标记PH值
PH值是决定胶体金标记蛋白质成功与否的关键因素。
蛋白质只有在等电点（PI）附近或稍偏碱性（PI+0.5）的条件下才能与胶体金牢固结合。
调节PH值时可以用碳酸钾（0.1/0.2M），或者不同浓度的Hcl，NaOH进行调节。
用0.2mM的碳酸钾调整胶体金溶液pH，依次为5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9，9.5。
各取1ml胶体金溶液，在每管中加入浓度为1mg/ml的SPA30ul混合均匀；
作用 40分钟后每管加入100ul的10%氯化钠溶液，摇床振荡10min，室温静置4小时，观察胶体金颜色是否有变化。
和空白对照比较，取胶体金溶液颜色没有改变的最低pH为标记SPA的最佳pH。

黄帮主

3. 胶体金的标记条件--最适标记量的确定
Mey氏稳定化试验测定其最佳标记量。
高浓度下标记体系的缩小，分子布朗运动碰撞效率提升，相应的蛋白质的标记效率也会增加。在40OD的情况下，一般的标记量为40-100ug/ml。
高浓度胶体金可以节省活材用量50%以上。
取10个1.5ml离心管， 各装500ul pH=6.2的溶液，每管加入1ug/ml SPA，混匀，10min后加入10%氯化钠溶液100ul，混匀，静置1小时；观察使胶体金溶液保持红色未变的最小SPA用量即为最低稳定量，最低稳定量的1.2倍即为最适SPA用量。

黄帮主

4. 胶体金-SPA探针制备
胶体金溶液冷却至室温后用0.2ml K2CO3调节至最适合pH；
磁力搅拌下，按照最适标记量加入SPA蛋白；
搅拌15-30min后加入金标抗体封闭剂和稳定剂（如：2ml10%的聚乙二醇20000）；
继续搅拌30min；
4℃，3500r/min离心15min，弃上清，沉淀物即为SPA标记胶体金探针，用四硼酸钠保存液恢复至原体积的1/10，4℃冰箱保存。
标记了SPA的免疫胶体金探针可以和IgG或者IgM的Fc端进行结合。用于捕获样本中的抗体。

黄帮主

5. 胶体金标记SPA复合物的鉴定：
在光照下颜色呈酒红色，清亮透明。
取制备的胶体金溶液5ml，用紫外/可见光谱仪观察胶体金质量；
用镍网蘸取金标蛋白溶液，空气中干燥后用磷钨酸复染，透射电镜下观察。
电镜下的胶体金颗粒，呈圆形或者椭圆形，大小均匀一致。金颗粒外周有明显的低电子密度晕圈，表明金颗粒表面吸附有蛋白质。

黄帮主

硝酸纤维素膜：