Dual-Function Antibodies to Yersinia pestis LcrV Required for Pulmonary Clear...

黄帮主的小跟班 · 发表于 2021-9-23 21:22:12

本帖最后由知识就是力量于 2021-9-27 09:09 编辑

Dual-Function Antibodies to Yersinia pestis LcrV Required forPulmonary Clearance of Plague
肺清除鼠疫所需的鼠疫耶尔森菌LcrV双功能抗体

黄帮主的小跟班 · 发表于 2021-9-23 21:22:52

本帖最后由黄帮主的小跟班于 2021-9-23 21:24 编辑

三种单克隆抗体，可保护小鼠免受腺鼠疫肺鼠疫攻击
2. Anderson, D., N. Ciletti, H. Lee-Lewis, D. Elli, J. Segal, K. Overheim, K. DeBord, M. Tretiakova, R. Brubaker, and O. Schneewind. 2009. Pneumonic plague pathogenesis and immunity in Brown Norway rats. Am. J. Pathol. 174:910–92127. Hill, J., C. Copse, S. Leary, A. Stagg, E. Williamson, and R. Titball. 2003.Synergistic protection of mice against plague with monoclonal antibodiesspecific for the F1 and V antigens of Yersinia pestis. Infect. Immun. 71:2234–2238
48. Sofer-Podesta, C., J. Ang, N. Hackett, S. Senina, D. Perlin, R. Crystal, andJ. Boyer. 2009. Adenovirus-mediated delivery of an anti-V antigen monoclonal antibody protects mice against a lethal Yersinia pestis challenge. Infect.Immun. 77:1561–1568

黄帮主的小跟班 · 发表于 2021-9-23 22:02:52

针对保护性抗原LcrV的抗体被认为中和了其在III型分泌系统(TTSS)中的基本功能，并能够在小鼠模型中诱导产生对鼠疫的免疫反应。
为了开发多价LcrV抗体作为治疗选择，我们筛选了抗LcrV的单克隆抗体(MAb)，以阻止其在III型分泌系统中发挥作用。虽然我们能够鉴定出这些单抗和联合单抗对III型分泌系统具有高水平抑制作用的，但这些单抗在体外并不能增强吞噬功能，在小鼠肺鼠疫模型中也只能起到微弱的保护作用。只有一种单克隆抗体BA5能够保护小鼠免受肺鼠疫的攻击。在体外，单抗BA5阻断TTSS的效果与其他单抗或联合单抗相当，甚至低于其他单抗，但其活性可使吞噬功能增强。
多克隆抗LcrV在促进吞噬功能方面优于BA5，对小鼠肺鼠疫也有较好的保护作用。
综上所述，这些数据支持了一种假说，即抗体通过肺清除鼠疫耶尔森氏菌需要中和TTSS和同时刺激吞噬细胞用来摧毁病原体的固有信号通路。

黄帮主的小跟班 · 发表于 2021-9-23 22:07:34

本帖最后由知识就是力量于 2021-9-27 11:29 编辑

F1和V是两种保护性抗原，都能引起中和性抗体反应，可以应用于被动免疫或者基因疗。这些中和性保护抗体直接作用于细菌并改变其与固有免疫细胞的相互作用，从而使宿主清除感染。
T细胞反应也被认为在宿主防御鼠疫耶尔森菌中发挥重要作用。

黄帮主的小跟班 · 发表于 2021-9-23 22:09:32

本帖最后由知识就是力量于 2021-9-27 14:09 编辑

CaF1或F1是一种丰富的细胞表面抗原，37°C在鼠疫耶尔森菌上形成荚膜结构。尽管F1似乎具有抗吞噬作用，但它对毒力并不是必需的，因此不会对鼠疫菌突变体caF1产生免疫作用。

黄帮主的小跟班 · 发表于 2021-9-23 22:16:01

本帖最后由知识就是力量于 2021-9-27 15:01 编辑

V抗原：LcrV在III型分泌系统(TTSS)中发挥作用，它对所有形式的鼠疫都是必不可少的。
LcrV在37℃时位于细菌表面，介导耶尔森菌外源蛋白(Yops)的转运，YOPS具有抗吞噬、溶解细胞和促细胞凋亡的作用，协助耶尔森菌避免被宿主免疫系统杀死。

黄帮主的小跟班 · 发表于 2021-9-23 22:22:56

本帖最后由知识就是力量于 2021-9-27 15:58 编辑

重组LcrV (a-LcrV)的多抗可以结合在针尖上，抑制TTSS和细菌的吞噬作用。然而，是a-LcrV直接抑制TTSS导致吞噬作用，还是直接促进吞噬作用导致抑制TTSS，因为它不能在细胞内发挥作用，仍存在争议(59,60)。？？？啥意思
三种单克隆抗体(MAbs)已被独立克隆，可保护小鼠免受腺鼠疫和肺鼠疫。虽然尚不清楚这些抗原表位是否相同，但研究表明存在多个保护性抗原表位。

黄帮主的小跟班 · 发表于 2021-9-23 22:33:47

本研究主要探索肺鼠疫的保护机制，以确定多价抗体是否可以提高对腺鼠疫的保护。研究表明，可直接促进吞噬功能的中和抗体对肺鼠疫的保护效果更好，仅能抑制TTSS的也能提供部分保护
只有单个LcrV表位即可与抗体结合，而单克隆抗体对抗原的多价占据并没有增加吞噬作用或保护作用。这些数据提供了对 LcrV 机制的新见解，并支持通过测定鼠疫杆菌的吞噬细胞摄取作为评估鼠疫疫苗的免疫相关性的方法。

黄帮主的小跟班 · 发表于 2021-9-23 23:08:28

本帖最后由黄帮主的小跟班于 2021-9-23 23:18 编辑

菌株：
肺鼠疫小鼠模型攻毒：鼠疫菌o92
在巨噬细胞的体外检测中：鼠疫耶尔森氏菌KIM D27
兔抗血清的制备：重组表达V抗原，免疫新西兰兔，产生的抗体血清
LcrV MAb E11 的制备：除 E11 外的所有单克隆抗体 (MAb) 克隆都是在免疫的 BALB/c 小鼠中针对重组 LcrV 产生的。E11是化学合成了241 ~ 270个LcrV氨基酸。
单抗的表达纯化：b细胞杂交瘤表达单克隆抗体，在无血清培养基或生物反应器中培养。从培养上清中获得抗体，用Protein G亲和层析纯化。
ELISA
竞争ELISA
巨噬细胞实验：Caspase-3：无法理解
实验动物：6-8w C57BL/6,16-20g,攻毒后观察14天
攻毒实验：6000 CFU/0.02 ml，对应于20 LD50(15,35, 52)。每组5只小鼠，攻毒前60min，分别给予抗体(400 g/0.4 ml)或PBS，腹腔注射。

统计学分析：采用单因素方差分析(ANOVA)评估caspase-3数据的统计学意义。ANOVA后采用Dunnett’s检验来解释I型错误，多重比较和报告的P值是两种检验的合并结果。使用未配对学生t检验来评估庆大霉素保护试验收集的数据的统计学意义。采用log-rank检验评价存活和平均死亡时间(MTTD)的统计学意义。

黄帮主的小跟班 · 发表于 2021-9-23 23:11:45

本帖最后由黄帮主的小跟班于 2021-9-23 23:35 编辑

最初，单抗被鉴定为具有在体外阻断III型Yops注射的能力。为了进行这项分析，我们修改了caspase-3分析方法，该方法目前用于评估LcrV疫苗的效力(7,53)。
野生型鼠疫耶尔森氏菌D27注射Yops，其中YopJ可引起caspase-3的激活和巨噬细胞的凋亡(36)。
缺乏编码TTSS的pCD1的同基因鼠疫菌无法激活caspase-3。在每个实验中，野生型和pCD1鼠疫菌，分别设置caspase-3激活率为100%和0%。
图一：单克隆抗体BA5和AH1阻断YopJ注入巨噬细胞。100微克抗体或等量PBS与鼠疫菌KIM D27 37℃预孵育1小时后感染RAW 264.7巨噬细胞样细胞。以PBS处理过的鼠疫菌KIM D27作为对照，不注射抗体。然后将预处理过的细菌加入巨噬细胞中，MOI为10。感染3.5 h后检测Caspase-3的活化情况。

图二：与LcrV结合的多价抗体导致TTSS的阻断增加。混合了等量的单克隆抗体，合计100g抗体或等量的PBS与鼠疫菌KIM D27在37℃预孵育1小时，然后感染RAW 264.7巨噬细胞，MOI为20。

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