鼠疫耶尔森氏菌 rV270 抗原的克隆、表达及其免疫保护作用评价

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王棠 期刊 导师杨馥瑞

目的: 为研制鼠疫亚单位疫苗, 克隆、表达并纯化去除产生免疫抑制作用序列后的鼠疫耶尔森氏菌 LcrV 抗原( rV270) 。
方法: 依据已知的 LcrV 的核苷酸序列, 避开其产生免疫抑制作用的区段设计引物, 扩增 rV270 基因并克隆到pET24a 载体中, 在大肠杆菌 BL21 中表达 His- rV270 融合蛋白; 表达产物先后经 Co2+亲和层析和 Sephacryl S- 200 HR 凝胶柱纯化, 并在纯化过程中应用凝血酶切除 His 标签; 氢氧化铝佐剂吸附重组抗原后免疫 BALB/c 小鼠, 初次免疫后第 21 天加强免疫 1 次, 第 5 周使用 104 CFU 鼠疫菌 141 强毒株攻毒, 测定其免疫保护作用。
结果: rV270 以可溶性方式表达; 应用Co2+亲和层析柱和 SephacrylS- 200 HR 凝胶柱结合凝血蛋白酶切除 His 标签的方法可得到不含标签的较高纯度的重组蛋白; 攻毒实验中实验组小鼠全部存活, 而对照组全部死亡。
结论: 获得了具有良好免疫保护作用的 rV270 蛋白, 可用于鼠疫亚单位疫苗的研究。

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目前在鼠疫菌中发现的保护性抗原有 F1( 荚膜抗原) [4]、LcrV ( V 抗原) [5]、YscF[6- 7]和 YopD[8- 9]蛋白。

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鼠疫耶尔森氏菌基因组包含 了染色体基因组及 pPCP1( 9.5 kb) 、pMT1( 100～110 kb) 和 pCDl ( 70～75 kb) 等 3 种质粒。
由 pCD1 质粒编码的 V 抗原是鼠疫耶 尔森氏菌重要的毒力因子、低钙反应调节因子和保护性抗原, 但 存在一定的免疫抑制作用[10]。
已证实重组的 V 抗原在小鼠模型 中能对致死量的鼠疫耶尔森氏菌感染产生保护性免疫[11], 并与鼠 疫菌主要抗原和毒力因子之一的 F1 抗原有很强的协同保护作 用。近来来, 在对 V 抗原的研究中发现了其产生免疫抑制作用的 区段。V 抗原上具有免疫保护功能的区域为第 2～275 位氨基酸 残基[11- 12], 去除产生免疫抑制作用区段后的部分 V 抗原( rV270) 可在有效降低 V 抗原的免疫抑制作用的同时保留其免疫保护作 用[11]。

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免疫抑制区 1995 没找到
[10] Nakajima R, Motin V L, Brubaker R R, et al.  Suppression of cytokines in mice by protein A2V antigen fusion peptide and restoration of synthesis by active immunization [J]. Infect Immune, 1995,63(8):3021- 3029.
V抗原小鼠模型保护效果
[11]Overheim K A, Depaolo R W, Debord K L, et al. LcrV plague vaccine with altered immunomodu latory properties [J]. Infect Im mun, 2005,73(8):5152- 5159.
[12] 李蓓. 鼠疫耶尔森氏菌 LcrV(V 抗原)的研究进展[J]. 微生物学免疫 学进展, 2004,32(2):S3

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设计引物
rV270扩增
重组表达质粒的构建
阳性克隆的筛选与鉴定
rV270抗原的诱导表达
表达蛋白纯化
wb鉴定目的蛋白 一抗用兔抗V igG？？？
免疫保护作用 10ug 20ug 对照组 第一次免疫后 21天加强免疫 56天攻毒 2000ld50 鼠疫菌141
                    6、8、10、12、14、16尾静脉取血，elisa检测抗体滴度