非洲动物锥虫病的纳米抗体

傲慢与偏见

Development of a Nanobody-based lateral flow assay to detect active Trypanosoma congolense infections

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非洲动物锥虫病（AAT）在撒哈拉以南非洲很普遍。对家畜有严重致病作用的锥虫有锥虫病属的刚果锥虫、活跃锥虫、以及布氏锥虫，对畜牧业造成很大影响。
本文中，用两株刚果椎虫分泌的混合物免疫羊驼，鉴定到一对识别糖酵解酶丙酮酸激酶的纳米抗体对Nb44/Nb42，可用于开发了ELISA和LFA检测试剂盒，检测实验感染小鼠和牛的血浆样本中的寄生虫。

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非洲动物锥虫病(AAT)是由锥虫寄生虫引起的一种热带病，主要影响撒哈拉以南非洲的牲畜。
AAT在大小反刍动物中出现从轻微到严重的病理变化，这导致受感染动物的肠胃力、肉和奶产量急剧下降。
在撒哈拉以南非洲地区目前约有5000万头牲畜面临感染风险。对经济发展有直接和间接的影响，每年的损失估计在10亿美元。
AAT主要的致病原是刚果锥虫、间日锥虫，少量的布鲁氏锥虫。
在许多农村地区，刚果锥虫和活跃锥虫感染的流行率很高(20-40%)。
有准确、灵敏和具体的诊断方法对于预防牲畜的AAT疾病很重要。

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基于抗体和基于抗原的检测都有各自的优点和缺点。
基于抗体的检测，其敏感性主要依赖于宿主体液反应的强弱，有两个潜在的缺点:
(i) 由于抗体交叉反应性，特异性低；
(ii) 在感染清除后数周至数月内，血液循环中仍然存在有持久抗体，干扰了对现有感染的诊断。

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针对刚果椎虫和活跃锥虫研发的抗体相关的免疫检测试剂已经成功运用到大规模的流行调查中。
抗原依赖的免疫检测试剂其灵敏性主要由循环系统中寄生虫抗原的数量决定的，后者量需要足够高才能被检测出来。对检测用抗体要求比较高，如果选用纳米抗体会减少很多麻烦。
纳米抗体能识别到传统抗体识别不到的表位，另外没有FC段，能减少和宿主抗体非特异性交叉反应，纳米抗体很容易改造成多价或者带有标签的抗体，更容易包被在胶体金表面，供胶体金试剂条制备。

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已经有采用纳米抗体检测刚果椎虫的ELISA试剂盒，灵敏度和特异度分别是87% [95% CI, 73–95%]和94% [95% CI, 71–100%]，使用良好，但是因为识别同源表位，不能改造为胶体金试纸条。本文中，采用了一对识别不同表位的纳米抗体对，可以开发为ELISA试剂盒或者胶体金试纸条。
Nb44/Nb42抗体对特异性识别糖酵解酶丙酮酸激酶。

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免疫抗原：两株刚果椎虫IL3000/IL1180分泌混合物。
100ug的免疫抗原和GERBU佐剂等体积混合后，免疫雄性羊驼，一周免疫一次，周期为6周。
末次免疫后第4天取50ml的血，分离淋巴细胞，反转录为cDNA，纳米抗体库克隆到pHEN42载体中。每轮筛选，抗原包被量为10ug/孔，三轮包被的抗原分别为第一轮为IL3000株分泌物，第二轮为IL1180株分泌物，第三轮为TC13株可溶性蛋白。

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筛选到五株有效抗体。

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在夹心ELISA实验中均能识别刚果锥虫，其中捕获抗体为HIS标签的Nb，检测抗体为带有HA标签的Nb。
对抗体对组合进行鉴定，一共有25种组合。


其中Nb44/Nb42组合ELISA结果显示较强的信号。并且两者不能互换，Nb42/Nb44组合ELISA则没有信号。

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Nb44/Nb42特异性检测
对感染有椎虫或者利什曼原虫的小鼠血清进行鉴定，只有刚果锥虫感染的样本在ELISA检测中有阳性信号。