Characterization of cis-Acting RNA Elements of Zika Virus by Using a Self-Spl...

傲慢与偏见

Characterization of cis-Acting RNA Elementsof Zika Virus by Using a Self-SplicingRibozyme-Dependent Infectious Clone

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寨卡病毒最近在美国引起爆发和流行，症状表现为小脑畸形和神经系统疾病。本文中采用了一个核酶依赖的自我剪切机制，构建了稳定的寨卡病毒感染性克隆。所用毒株来源于2016年从委内瑞拉传播到中国的毒株。本文中构建的寨卡病毒感染性克隆将P.li.LSUI2内含子序列插入到基因组的E-NS序列之间，通过体外实验，该内含子能很容易被切除掉，转染剪切后的RNA到BHK-21细胞，能产生子代病毒。
利用该克隆，对寨卡病毒的顺式RNA作用元件进行研究，对SLA和CS序列进行功能鉴定。
he ongoing Zika virus (ZIKV) outbreaks have drawn global concerndue to the unexpected causal link to fetus microcephaly and other severe neurological complications. The infectious cDNA clones of ZIKV are critical for the researchcommunity to study the virus, understand the disease, and inform vaccine designand antiviral screening. A panel of existing technologies have been utilized to developZIKV infectious clones. Here, we successfully generated a stable infectious clone of a2016 ZIKV strain using a novel self-splicing ribozyme-based technology that abolished the potential toxicity of ZIKV cDNA clones to the E. coli host. Moreover, twocrucial cis-acting replication elements (5=-SLA and 5=-CS) of ZIKV were first identifiedusing this novel reverse genetics system. This novel self-splicing ribozyme-based reverse genetics platform will be widely utilized in future ZIKV studies and provide insight for the development of infectious clones of other emerging viruses

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寨卡病毒属于黄热病毒属，1947年，在乌干达寨卡森林中首次发现。2007年，传播到太平洋，美国，引起大规模的爆发和流行。
感染后症状为消化道和神经系统疾病，包括小脑畸形等。
尚无特异性药物和疫苗。
反式遗传学用于研究病毒的复制和致病性，用于疫苗和抗病毒药物的筛选。
寨卡病毒长约11kb，基因组为正链RNA，含有一个大的读码框。
通常情况下，制备感染性克隆是在全长基因组前加入T7/SP6启动子或者真核RNA聚合酶II启动子。
除了常用的改进方法外，有两种插入外源序列的方法，一个是DENV3病毒感染性克隆的构建时，采用的加入一段含有正反方向终止密码子的短小序列进行空间阻隔，另一种是加入内含子序列，进入细胞后能被剪切。

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P.li.LSUI2 II类内含子最初发现于褐藻线粒体基因组的rRNA大亚基基因中。
像许多其他II类内含子一样，P.li.LSUI2内含子编码一个内含子编码蛋白(IEP)，具有RNA成熟酶和逆转录酶活性，用于体内自剪接和逆转录。P.li。在体外条件下，LSUI2内含子被证明有高效的自剪接作用。在本研究中，利用自剪接II组内含子策略成功组装了寨卡病毒全长cDNA。转录后的RNA可进行体外自剪接。
将剪接后的RNA转染BHK-21细胞，产生感染性子代病毒。亲本和拯救的寨卡病毒具有相似的生长形态、噬斑和小鼠神经毒力表型类型。表明回收的寨卡病毒很好地保留了亲本病毒的生物学特性。
利用这个新建立的反向遗传学系统，我们揭示了一组RNA元素的关键作用，包括5-茎环(SLA)和环化序列(CS)在ZIKV病毒RNA (vRNA)复制过程中，凸显了这种基于的自剪接内含子新策略在黄病毒感染性克隆生成中的可靠性和潜力。
利用寨卡反式遗传学系统，研究了一些RNA元件的功能，包括在病毒复制过程中5端茎环结构A(SLA）和环状序列（CS) 的作用，证实了新构建个寨卡感染性克隆的作用。

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I型内含子存在于某些生物的细胞核、线粒体和叶绿体中编码rRNA、mRNA和tRNA的基因中。
I类内含子是具有酶催化功能的内含子，转录成RNA后，可以自我剪接。
这类内含子转录后可以形成9个由碱基配对形成的特定的二级结构。
I型内含子具有自我剪接的功能，在剪接反应中，要有一种鸟嘌呤核苷(含有游离的3'-OH)G-OH。G首先结合到内含子的5'端,当线性的内含子成为环状时,其3'端可以距离5'端15个核苷酸以外,从而将原来的5'端和15个碱基(或以上)的节段(包括G)切除出去。这种自我剪接,是由RNA的特定序列的核酸内切酶的活性所催化。
Ⅰ型内含子比Ⅱ型内含子更普遍,这两类内含子之间没有什么关系,它们有一个共同的特性,就是在体外能够自我剪接,而不需要任何蛋白质酶的催化。但是在体内它们却都需要蛋白质帮助折叠成二级结构。

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II类内含子剪接机理同I类内含子的剪接相似，也要形成一个套索的中间体，通过形成5'-2'磷酸二酯键将要剪接的位点靠近到一起。II型内含子的剪接又不完全与I类内含子的剪接相同，它具有自我剪接的功能，不需要剪接体和snRNA的参与，也不需要ATP供能。
II型内含子的6个结构域可形成发夹环，结构域5与6之间只间隔3个碱基。

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使用细胞，菌株等BHK-21 (ATCC CCL10)，C6/36 (ATCC CRL-1660)，寨卡病毒毒株GZ01 (KU820898)，2016年从一个委内瑞拉回国的患者体内分离而得。
覆盖病毒全基因组的四个片段(S1- S4)通过RT-PCR获得，S1，S3，S4克隆到pGEM-T Easy载体中 (Promega), S2通过KpnI/KasI酶切位点插入到载体pACNR中。
以pACNR-S2为基础，插入S3，S4片段。
修饰处理的P.li.LSUI2内含子序列通过化学合成，融合PCR插入到S1片段，5‘端插入SP6启动子序列，再和pACNR-S234相连接，构建成全长pACNR-GZ01-Intron-IC。
构建5’端的SLA和CS的突变体，以S1-内含子质粒作为模板。
构建3‘端的CS突变体，以S4质粒为模板。
体外转录用Ribomax SP6 large-scaleRNA production kit (Promega)试剂盒，RNA的纯化用Purelink RNA minikit (Thermo Fisher Scientific), 混入等体积的自剪切缓冲液，45℃作用1小时，对RNA进行二次纯化，待转染。

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内含子序列：
CTTAGGGGGAGTGTTGATCTTTTTATGTGCGACAAGAAGTTCAGGAAGGGATTGAGGTGAAAGTCCTCCTCCCGAATCGTTCATGGGAGAGTCTATCCAGACTTGCGTAGCGAGTAATCGCTAGGTGAGAAGCTCTGGAGACAATGTACCTGCCCTTCAATTGGAGGTGCCAGGGCTAGGCTTTGTTCCTATGGCTAGCGAAAGCGAATACAGGTTATTAGGCGTCGTGAATCAAAAACTCTTTCGACATAAGGGAGAGGCTCGTAGATGAGTTACCCTCCATAAAATGGGGTAACTGAACGATCAATATCTACCGGCGTAGACTGTGAGCCTAAAGGAAACGAATGAAAGTGTCCCTTCCTGGGAACTTGGTAAGCCCAATAGACTCCCTCTGGGAAACCAGAGGAGGAGTAAGAGCAATCTTACTTATCGTCTAGTGGGTAAAAGACATAATAGGAAGCAAATGCTTGGTTGTAACGATCGAGATAGAATCTGTTGATTTAAGCTGAAAGGCTGCAGACTTATTAAATGGGTGTTCTGCTGTATGGCGTTCGCGCCTAAGCAGCAGAATGCGTGAGCCGTGTGCGATGAAAGTCGCAAGCACGGTTCTGATGGGGGGAAAACGAGAGATCGTCTACCTATCCAACTCCACAGCCGTCTCTGCTGATGTGGGGTGCTCGGTGGACTTCTCAAAGAAGGAGACGAGATGCGGTACC

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寨卡病毒拯救病毒：一开始，制备全长感染性克隆没有成功，选择插入内含子的方式来稳定感染性克隆。
用P.li.LSUI2内含子作为插入序列，插入到病毒基因组的2472-2473位，为确保能精准切割，P.li.LSUI2外显子结合序列进行改造，成为识别寨卡病毒基因组源的内含子结合序列。

P.li.LSUI2intron的二级结构如图，用VARNA软件进行模拟，内含子的EBS1-3序列被改造成为和寨卡病毒基因组上部分序列互补的序列IBS1-3。
灰色环状区域代表IEP编码区域。
C图代表内含子的三级结构，由PYMOL进行模建。

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RNA二级结构预测在线网站：进入网址RNA folder web server RNAfold web server (univie.ac.at)

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