A New Strategy in Design of RNA Virus Infectious Clones Enabling Their Stable...

傲慢与偏见

A New Strategy in Design of  RNA Virus Infectious ClonesEnabling Their Stable Propagation in E. coli

傲慢与偏见

文章中应用了新策略，解决了感染性克隆在细菌中不稳定的问题。理论基础是在原核和真核细胞中RNA加工过程的不同。
日本脑炎病毒属于黄热病毒属，正链RNA病毒。
为了构建一个稳定的包含CMVp/e启动子的感染性克隆，在基因组中加入内含子进行稳定。
iDNA转入BHK细胞后，启动了病毒复制，产生拯救病毒。

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所用材料：包括BHK和Vero细胞。病毒株包括野生病毒株JaOArS982。
拯救病毒在VERO细胞中进行培养。
所有实验在生物安全3级实验室中完成。
核酶保护实验 ribonuclease protection assays (RPA)

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原来构建的质粒pM343，pH756,分别含有JEV基因组的5'和3'端。
其中， pM343在细菌中很不稳定，在培养过程中出现的大菌落克隆，往往在E基因的末端有无义突变。
利用改造的pM343 (pT7JE59)和改造的pH756( pJE39/Asp), 构建全长的JE感染性克隆pT7JE/Asp，骨架载体为pBR322。以此感染性克隆进行体外合成的RNA具有感染性，拯救病毒和母株JaOArS982一致。
这部分的工作此时尚无报道，后续可能有发表文章。
在这篇文章中，报道的是CMV启动子操控下的JE全长感染性克隆。

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质粒改构：本文中，采用HB101作为转化细菌。
pT7JE5‘ 质粒来源于质粒pM343，含病毒株 (strainJaOArS982) 基因组的1–5576位，基因前为T7启动子，在2023位有一个核苷酸的缺失。pJE39/Asp质粒来源于质粒pH756 ，含病毒株基因组的5576–10960，将原质粒的JEV基因序列插入到pBR322质粒中，并且添加了Asp718酶切位点。
pT7JE/Asp感染性克隆时将上述两个质粒进行连接。
CMVp/e-5’JE融合片段是通过融合PCR获得，从pCIneo扩增 (pos.6–744）的CMV部分，末端加入Sal I酶切位点，再加入JE片段(pos. 1–943)。
内含子来源于pCIneo质粒 (pos. 890–1022)通过位于354和2215位的Ecl136 II酶切位点插入到JEV基因组中。
先后构建了pCMVp/eJE5‘(i356i2217) 和pCMVp/eJE5’(i356)，再加入3‘端的JEV序列构建了全长克隆pCMVp/eJE(i356i2217)和 pCMVp/eJE(i356)。
最后 从pcDNA3(pos. 1021–1286)上扩增一段BGHTT序列，插入到全长克隆质粒中。 构建终极质粒pCMVp/eJE(i356i2217)BGHTT和 pCMVp/eJE(i356)BGHTT.
另外，在全长克隆的基础上，去掉Mlu I之间的片段，得到pCMVp/e5’Δ3‘BGHTT，用于对JEV的5’端和3'端序列进行图谱分析。
JE的片段(pos. 1–175) 插入到pGEM3 载体中构建负链探针，用于进行核酶保护实验。

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在构建上述质粒时，CMVp/e加上JE的5‘ 端序列的质粒很难构建成功。Presumably, the instability of the plasmids was caused byCMVp/e, since substantial transcriptional activity in E.coli has been reported for this and other eukaryoticpromoters (Davis and Huang, 1988; Antonucci et al.,1989). Earlier we noticed that nonsense mutations upstream from hydrophobic domains present at the end ofE and beginning of NS1 (Fig. 1a) often resulted in stabilization of the pT7JE59 plasmid. We intentionally introduced stop codons upstream from this region as part ofan intron. A site for Ecl136 II, GAG/CTC, located at pos.2215 upstream from the problem region, was used forinsertion of a 132-bp chimeric intron producing sequence59 . . .GAGGT...AGCTC. . .39 (an abbreviated sequence ofthe intron is in bold). Precise excision of the intron due tosplicing in mammalian cells would restore the originalrestriction site, thus providing a simple means to monitorprocessing of transcripts. Although the resultingpT7JE59(i2217) plasmid appeared stable, replacement ofthe T7 promoter with CMVp/e caused substantial destabilization of the construct since the majority of recoveredplasmids contained various rearrangements. One ofpCMVp/eJE59(i2217) plasmids appeared to contain the JEfragment of the correct length; however, transfection ofthis plasmid into BHK cells did not result in JE-specificcell fluorescence (Fig. 3, panel a-1). A 5-nt frameshiftdeletion was found upstream from the region encodingthe prM signal sequence, suggesting that expression ofthis genome region may have caused destabilization. Toalleviate this problem, a second copy of the same intronwas inserted in the Ecl136 II site, created at pos. 354upstream from this genome region (Fig. 1a). The resulting pCMVp/eJE59(i356i2217) construct had excellent sta

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RNA剪接（RNA splicing）：

从DNA模板链转录出的最初转录产物中除去内含子，并将外显子连接起来形成一个连续的RNA分子的过程。

RNA剪接是真核细胞基因表达中非常重要的一个生物过程，通过RNA剪接，可以产生许多具有功能的，带有编码信息的mRNA，它对生物的发育及进化至关重要。所以RNA剪接识别是正确理解基因表达过程的重要一步，而剪接的识别的关键是依赖于剪接位点的判定。

真核细胞pre-mRNA的剪接位点处存在一定的序列保守性，对于它所对应的cDNA序列而言，内含子5’端（供体位点）和3’端（受体位点）的碱基都是GU和AG，因此称做GU-AG规则。