制备常用抗体的相关实验

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抗体的生物素标记：
由于 scFv 溶解于 1×TE（pH8.0）中，其中 TE 中的 Tris 会干扰标记反应，因此需要用截留分子量为 3 kD 的超滤柱对 scFv 进行处理，具体的标记步骤如下：
（1）将抗体溶液置换到0.1M的碳酸氢钠溶液中。在截留分子量为3 kD的超滤柱中加入一定量的scFv，加入0.1mol/L NaHCO3缓冲液，8000 g 离心 30 min，超滤 3 次，测定最终产物的蛋白质浓度。
（2）配置生物素：计算所需生物素的总量，微管中加入 180 μl 的超纯水使生物素的终浓度为 10 mmol/L，配后一定即刻使用。
（3）生物素反应：生物素溶液配好后，按 scFv：生物素=1：20 的比例（摩尔比）立即将生物素加入到蛋白质溶液中，漩涡混匀仪上混匀后装入不透明袋中，最后将不透光袋放到旋转混合仪上室温孵育 40 min。
（4）将生物素标记的抗体置换到PBS溶液中。将完成反应的混合液加入到截留分子量为 3 kD 的超滤柱中，加入一定量的PBS，8000g 离心 30 min，超滤 3 次。
（5）将超滤后的 scFv 通过 PBS 定容至合适的体积（使产物的终浓度0.5mg/ml-1mg/ml）。
（6）加入终产物体积 10%的 2% BSA，加入终产物体积 50%的甘油，-20℃冻存备用。

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半抗原偶联在大分子载体上：
半抗原，有反应原性，但无免疫原性。如要诱发小鼠的免疫应答，必须具有免疫原性，而通常分子量在 10000 以上的物质会具有免疫原性。
通过将小分子和大分子偶联来制备免疫抗原。
利用偶联剂将其连到大分子载体，方法有碳二亚胺法、戊二醛法、混合酸酐法、高碘酸钠法等。
通常的大分子载体蛋白有 KLH（血蓝蛋白）、BGG（牛血清丙型球蛋白）、BSA(牛血清白蛋白)、OVA (卵清蛋白)等。
本文的载体蛋白选用 BSA、BGG。
制备得到的人工免疫抗原进行效价检测、特异性检测，性能最佳的抗原用于小鼠免疫中。

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Protein G
是一种从G型链球菌属分离得到的细胞壁蛋白。
天然Protein G有3个IgG结合域，同时也具有白蛋白和细胞表面结合域。
重组Protein G去除了白蛋白和细胞表面结合域，以减少非特异性结合。
Protein G可用于纯化不能与Protein A很好结合的哺乳动物单抗和多抗IgG。
相对于Protein A，Protein G对于大多数哺乳动物的IgG有着更高的亲和力，尤其是对于IgG的亚基，如人 IgG3，小鼠IgG1和大鼠IgG2a。
与Protein A不同，Protein G不结合人IgM，IgD，或IgA。

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protein A
重组蛋白A同琼脂糖凝胶结合后可制备用于抗体纯化的亲和填料，可从腹水、血清、细胞培养上清或细胞抽提物中分离和纯化多种哺乳动物不同亚型的抗体或包含抗体Fc片段的基因工程重组蛋白。
在天然金黄色葡萄球菌蛋白A的基础上对蛋白质结构进行了改造，与天然蛋白A相比，去除了Fab片段的结合位点，增强了与Fc片段结合的专一性，同时提高了蛋白质的稳定性和耐碱性。

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二抗的选择：
① 种属来源：主要根据一抗种属来源而决定二抗来源
② 标记物的选择：有HRP、Biotin、荧光素等标记物。免疫组化，WB二抗主要选择HRP，Biotin标记的二抗，而免疫荧光染色可按实验需要选择不同荧光素标记的二抗，如FITC、Cy3、PE等。

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二抗的制备：（传统老方法）

1.材料
① 正常兔血清：收集新鲜正常兔血清，加入1‰的叠氮钠防腐，可以在0℃保存。
② 饱和硫酸铵
③ DEAE纤维素22
2.兔IgG提取：
硫酸铵盐析：

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短肽抗原制备：
① 免疫用：称取短肽4.4mg和5mgOVA溶于1ml的PB缓冲液中（PH=7），充分溶解后，将200uL含有2.2mgEDC的PB缓冲液逐滴加入，边滴入边混匀，摇床100r/min反应4小时，4℃静置过夜，用0.01M的PBS（PH=7）进行透析，-20℃冻存备用。
② 包被用：称取短肽4.4mg和5mgBSA溶于1ml的PB缓冲液中（PH=7），充分溶解后，将200uL含有2.2mgEDC的PB缓冲液逐滴加入，边滴入边混匀，摇床100r/min反应4小时，4℃静置过夜，用0.01M的PBS（PH=7）进行透析，-20℃冻存备用。

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IgG Fab 片段的制备：
IgG 分子量为 150 kD 左右，由 4 个亚基组成，即两条重链（ H）和两条轻链（ L）。用水解酶（木瓜蛋白酶）水解后可得到两种片段，即 Fab 和 Fc。
其中 Fab 是具有抗原识别活性的部分， 能够与 Protein A 和 Protein G 特异性结合。
其基本过程如下：
(1) 用 PBS（ pH 7.0，含 10 mM EDTA， 20 mM 盐酸半胱氨酸）溶解纯化的 IgG
(2) 加固化木瓜蛋白酶
(3) 37℃处理 5h
(4) 离心，去除固化木瓜蛋白酶（沉淀）
(5) 过 Protein G 柱进行纯化。

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铜催化得叠氮与炔基加成得点击反应：
可用于小分子或者多肽与蛋白或DNA偶联。

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EB病毒转化建立分泌人单抗B淋巴细胞系：
EB病毒转化B淋巴细胞，获得抗体分泌的永生化细胞株。约有1%的循环B细胞能形成永生化细胞株，其中静息状态下的B淋巴细胞比激活状态下的B淋巴细胞更易永生，另外来自EBV阳性个体的T细胞抑制B细胞永生。因此，在培养永生化B细胞时，需要将免疫T细胞被从培养物中移除，或者使用环孢菌素 A破坏T细胞功能。实验步骤分为3个部分：① 制备病毒；② 制备靶细胞；③ EBV感染，制备永生化细胞。