single domain antibodies：methods and protocols

傲慢与偏见

2012版

傲慢与偏见

第一章：
原版，可下载。

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1975年，Kohler等创建了杂交瘤技术制备单抗后，经过几十年的发展，产生了一系列的用于治疗的抗体药物分子。这些抗体药物分子有的是全抗分子，有的则是抗体片段分子。在本章中，对治疗性抗体发展史进行一个回顾，并着重抗体片段的巨大潜力，可用于构建双价抗体，双特异性抗体，或作为细胞修饰剂，如胞内抗体或细胞表面表达分子。

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单抗技术建立以来，人们一直致力于优化单克隆抗体(Mab)的功能特性，降低其免疫原性，提高临床疗效。在20世纪80年代初，绝大多数单抗来自啮齿类动物，这样会引起一个很大的问题，当给患者使用鼠源单克隆抗体时，产生高滴度的人抗鼠抗体(HAMAs)，减弱甚至碍了单抗的治疗效果，产生强烈的副作用。已知全抗IgG的Fc区域主要和免疫原性相关，当时对抗体的改造策略很少关注到抗体片段，而主要是使用细胞工程和分子工程技术，在全抗分子中引入尽可能多的人类源序列来降低小鼠单抗的免疫特性。

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当时以全抗分子，而不是抗体片段来开发治疗性抗体主要基于以下原因，Fc段决定抗体的效应功能，如补体激活，和FcγRs受体结合，和新生儿Fc受体结合延长抗体在血清半衰期。获得临床有效的单抗药物需要充分发挥效应功能，有足够长的半衰期。在有一些实验中已经观察到，单克隆抗体有中和细胞因子、毒素或病毒生物活性的能力，这些抗体不需要Fc段，直接可以和靶细胞结合，不过，当时IgG片段的使用非常有限。

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当时，因为没有操作方便的蛋白重组技术，抗体片段的获得主要靠生化反应，工业化生产是一个相当大的挑战。因此，主要还是IgG全抗分子用于开发为治疗性抗体。
但是也有如阿昔单抗Abciximab，1993年12月获得美国食品药品管理局（FDA）批准，应用于经皮冠状动脉介入治疗（PCI）患者，用于预防心脏缺血并发症；阿昔抗体是GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂7E3，因其抗原性强，限制了临床应用，将Fc片段去掉，只保留有活性的Fab片段与人免疫球蛋白的恒定区重组，构成人-鼠嵌合型Fab。另外，如雷珠单抗，赛妥珠单抗药也是Fab抗体片段。
在本章中，我们将回顾治疗性抗体从开发全抗渐渐到发展抗体片段的过程。

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杂交瘤技术之前，采用EB病毒转化技术，建立分泌人单抗B淋巴细胞系。将EBV转化B淋巴细胞，经过筛选，约有1%的循环B细胞可获得抗体分泌的永生化细胞株。由此得到抗破伤风，抗HIV的单抗。但是该技术存在的缺陷是产量低，稳定的细胞系不易获得等。值得注意的是，病毒感染患者的EBV转化记忆B细胞和CpG的刺激下产生大量的EBV转化细胞系，产生高亲和力的特异性IgG单抗。
其他基于细胞工程的方法，如使用优化的融合伴侣、体外细胞免疫或人B淋巴细胞的长期生长等技术也被证明效率很低。
单抗技术在20世纪80年代初迅速发展起来，并成为抗体工程的主导力量。

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分子工程技术的快速发展能更好地理解抗体分子的结构组成，免疫球蛋白的3D结构。构建嵌合型抗体和人源化抗体技术也随之发展起来。
嵌合型抗体的可变区来自啮齿类动物，恒定区来源于人源的轻重链。
人源化抗体可以通过CDR移植，表面重塑等技术制备而得。
人源化抗体的构建技术更为复杂，并且改造后的抗体亲合力降低，甚至抗原结合能力完全丧失。
结合丙氨酸扫描技术或共结晶反应分析抗原--抗体反应，能对人源化抗体的构建有所帮助。
目前在市的抗体药物中不少于10株为人源化抗体。

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噬菌体展示技术的出现巧妙地实现了抗体片段的表达，对VH和VL进行组合，可表达单链抗体和Fab抗体片段。
在数十亿对VH/VL中快速选择特异性抗体，还可以使用定点诱变或随机诱变进行亲合力成熟。此外，酵母展示技术，核糖体展示技术，转基因小鼠技术的发展都促进了抗体工程发展，越来越多的抗体片段，人源化抗体，转基因鼠/噬菌体库筛选得到的抗体获批，得以临床应用。

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20世纪50年代末，波特等研究发现，用木瓜蛋白酶可以将兔的IgG切割成三个片段(其中两个为Fab片段，一个是Fc片段)。
这个开创性工作使得免疫学家能够很好理解抗体的分子结构，通过晶体学研究抗体片段的三维结构，研究各片段的功能。
木瓜蛋白酶水解全抗分子形成两个Fab片段和一个Fc片段，胃蛋白酶水解全抗分子形成一个F(ab)’2片段和若干多肽碎片pFc‘，F(ab)’2片段重链间的二硫键断裂，则形成2个Fab’片段，Fab’片段可以进一步分解为Fv片段。
因为抗体片段缺少Fc区，减少了抗体和细胞之间的非特异性结合，因此广泛应用在受体研究中。
用蛋白水解酶去除掉马抗破伤风抗体得到的抗体片段也首次用于人的抗破伤风被动免疫中。