single domain antibodies：methods and protocols

傲慢与偏见

筛选Nb的技术可以有噬菌体展示，细菌展示，酵母菌展示，核糖体展示技术，质谱分析，CIS展示等技术。
产生免疫库的关键是用抗原免疫驼类。免疫动物需要动物伦理委员会的认同才能执行。
免疫周期通常需要6-12周，抗原需要总量大约为0.5mg，根据抗原性可以进行调整。
抗原的质量非常重要，折叠正确，稳定的蛋白能产生很强的免疫反应。
而聚集，降解，或者蛋白水解，不稳定的蛋白质，柔性寡肽，小的半抗原等等，免疫原性都不强，不过弱免疫原性也有可能刺激产生免疫反应，筛选到相应的Nb。值得注意的是，多种抗原还可以进行混合，用于免疫一只动物，免疫结束后，采集50-100ml的血液，含有足够的产生重链抗体的B细胞用于建免疫库，库容量达到10^6-8左右。

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从免疫骆驼的血液或淋巴结中分离淋巴细胞可进行免疫Nb文库的构建；
有研究小组对转基因小鼠进行了研究，将小鼠IGHM和/或IGHG基因进行截断，删除CH1结构域；
进而将小鼠内源性的鼠IGHV基因失活，将驼类IGHVH基因或者人IGHV基因敲入。
因为抗原用量少，饲养费用少，使得这种转基因小鼠的免疫比免疫美洲驼或骆驼更有优势。
此外，在转基因小鼠中使用人类IGHV基因，产生了组装有人类VH结构域的重链抗体，会避免Nbs用于人类治疗时产生的免疫原性问题。

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在欧洲，一直有倡议禁止使用动物免疫用于抗体生产。由此，天然库或者合成库成为筛选抗原特异性抗体的首选。
但是，和Scfv库等不同，Nb的天然库没有VH-VL之间的重组，以及IGHVH基因本身数量不多，需要采集多头骆驼血，得到大容量的抗体库，用于筛选到高亲合力的抗体。噬菌体展示技术中，10^10库容量是对其操作的最大值，需要更大的库容量可以选择用核糖体展示技

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构建合成库时，首先选择一些容易表达并且稳定的VHH作为框架，在CDR区进行氨基酸序列的随机突变以及长度多样性的改变。
库容量越大，越利于筛到高亲和力的抗体
库容量的大小受筛选方法的影响，噬菌体展示技术库容量可操作10^10的合成库，核糖体展示技术可操作10^14库容。

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现阶段，免疫库+噬菌体展示技术依旧是最广泛应用的筛选Nb组合技术。和天然库等相比，使用免疫库进行筛选相当于已经从开始进行了抗原特异性抗体的富集，
可以采用表型筛选，而不是仅仅抗原结合的筛选。如在针对病毒，细胞内致病原，毒素时，鉴定得到相应的中和抗体。将Nb免疫库通过病毒包装等手段直接转化到宿主细胞中，用病毒，致病原，毒素等进行筛选，能有效抵抗这些有毒成分的Nb转化细胞，能得到有中和活性的Nb分子。

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1995年，在护士鲨体内发现NAR，最初认为与T细胞抗原受体（T Cell Receptor，TCR）同源性较高，从而被命名为新抗原受体NAR，后续研究发现该分子与免疫球蛋白存在诸多类似的结构及功能特性，重新命名为IgNAR。IgNAR没有轻链，其中可变部分（VNAR），分子量约为13-14kDa。稳定性好，能在异质表达系统中进行表达，本章中，对IgNAR进行了溯源，生物技术发展，以及VNAR蛋白表达中的重要影响因素。

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1990年代，开展单域抗体样的结合试剂的研究。
传统抗体被设计成ScFv和Fab抗体片段，同时在探索发现更小的抗体片段，如VH片段、v样结构域、纤维连接蛋白和T细胞受体。
从骆驼体内发现得到的VHH片段，说明自然界天然存在着能产生稳定且有功能抗体小片段的解决办法。VHH结构研究发现，因为存在延长的CDR3区，环内的二硫键增加了VHH的稳定性，可溶性，和结合界面。
在这样的背景下，新发现的鲨鱼免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)抗体亚型相对没引起足够的注意，发展比较缓慢。

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1995年, Martin Flajnik和同事在Nature上发表文献。他们从弗罗里达护士鲨血构建得到的cDNA文库，最初用于筛选免疫球蛋白或者T细胞受体分子，首次描述发现了新型IgNAR亚型抗体。很明显，这些分子与以前鉴定的免疫球蛋白不同，虽然最初和T细胞受体归为一类，但是这些抗体在CDR1和CDR3区之间表现出显著的不同。IgNARs没有轻链，重链由1个可变区和5个恒定区组成。

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IgNAR可变区的序列(VNARs）只有大约13 kDa，提示在结构域-结构域接触中重要的残基(例如抗体VH-VL二聚化)发生了突变或缺失。
在第二篇文章中，Flajnik和同事通过免疫电子显微镜发现，单独的VNAR结构域在溶液中是独立的，完整的IgNAR分子很可能通过二聚体形式增强了亲和性。
强烈建议读者阅读这两篇早期的论文，以便了解对抗体/TCR前体性质的基础研究，并且引导出目前的鲨鱼抗体技术。

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VNARs真的是抗体分子吗？CDR1和CDR3区的可变性，标准的可变区--恒定区分子构成，分子的跨膜区结构，分泌性表达等特性都佐证了VNARs是抗体分子。
但是正式验证VNARs是抗体分子，是在免疫鲨鱼后，能产生特异地VNAR反应。
组织学清晰地鉴定出了鲨鱼负责VNAR产生和成熟的免疫器官和组织，它们与产生鲨鱼IgM和IgW类抗体的器官和组织一致。