single domain antibodies：methods and protocols

傲慢与偏见

经过20年的努力，首个基于纳米抗体的药物caplacizumab(抗血管性血友病因子)获批，展现了纳米抗体药物的临床价值。
鲨鱼中发现的免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)的可变区域(VNAR)也是一种新型的，区别于传统抗体片段，驼类重链抗体的单域抗体片段。比起哺乳动物抗体片段，VNAR具有增强的热稳定性和不寻常的凸型抗体表位。
VNAR能结合隐形表位和潜在表位的倾向性促进了和新抗原，抗原新的中和表位之间的结合，这些特征定位了VNAR平台可作为治疗，诊断和试剂开发的非抗体结合区域，在本引言章中，我们着重介绍了VNAR最近的进展，进一步强调了令人兴奋的进展，以及VNARs平台的潜力。

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蛋白工程技术已经成功将传统抗体改造成小的抗体片段，如Fab，单链抗体，VHH，VH，VL等，甚至更小的结合蛋白，如亲和体Affibodies，经设计的锚蛋白重复蛋白DARPins, 抗体模拟物Adnectins等等。但是大约4.5亿年前，大自然已经在软骨鱼类上提供了一种简化的解决方案。
直到20世纪90年代初，人们发现鲨鱼复杂的免疫系统中具有非常规的“抗体”(抗体样免疫球蛋白)，现在被称为免疫球蛋白抗原受体(IgNARs)。
只有重链的IgNARs在几种不同种类的鲨鱼身上发现了，包括护士鲨，斑须鲛，白斑角鲨，棘鲨，竹鲨，斑点猫鲨，光滑的角鲨，角鲨等。在2003年，对护士鲨进行免疫，证实其可变区，又被称为可变新抗原受体(VNAR)能自主结合抗原位点，等同传统的VH/VL结构区功能。

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IgNAR是只有重链的同二聚体，抗原结合位点是两个相同的独立的可变区 (VNARs)。VNAR只有两个CDR区，CDR1和CDR3。CDR2的缺失使得VNARs成为天然存在的有全部抗原结合表位的Ig样蛋白结构。
缺乏CDR2区通过CDR3区变长，增加多样性进行代偿。
VNARs根据其半胱氨酸在FR区和CDR区的位置和数量主要分为三种亚型：典型的半胱氨酸存在于三个亚型的FR1和FR3b区。
I型VNARs在CDR3区有两个半胱氨酸，分别和FR2和FR4的半胱氨酸形成二硫键。该型抗体只存在于护士鲨体内。II型VNARs在CDR1和CDR3区形成一对二硫键。

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IgNAR (IgNAR V 结构域)的可变区展示出几个独一无二的特征，和骆驼VHH结构域有所区分。vNAR结构域没有CDR2区，所以β-折叠仅为8个，而不是传统抗体的10个，所以是迄今为止，已知的动物界种最小的。

由于在框架2-CDR2区域中的删除，b-三明治折叠仅为8个而不是10个b链，使得成为迄今为止，在已知的动物界中最小的与抗原结合的抗体样结构域，其分子量约为12kDa因此，IgNAR V结构域仅具有两个互补决定区CDR1和CDR3然而，在CDR2截断位点，剩余的表面暴露环形成“带状”结构，并且显示在抗原接触之后，体细胞突变的高比率也发生在该循环中，并且在对应于 HV4在T细胞受体中，vNAR结构域显示出结构相似性。因此，这些区域分别被称为HV2和HV4。

有趣的是，我们的团队最近已经发现，通过将HV2与酵母表面展示随机化结合，该表面暴露环可以以其作为自主性对映体的方式进行工程化,仅仅促进抗原结合。这项工作可能为双特异性vNAR结构域的构建铺平道路，这代表着迄今为止已知的最小的双特异性抗体单位。

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基于在经典抗体结构域中没有发现的非规范二硫键的数目和模式进行分类，存在几种不同类型的vNAR分子，因此，不同类型的vNAR结构域形成了非常多样化的其它的二硫桥。因此，抗原特异性克隆可以从前所未有的不同环结构的库中选出。此外，这些鲨鱼抗体结构域的互补体的结构似乎倾向于靶向抗原的裂缝，而这些凹陷表位通常对于常规抗体来说是不具备免疫原性的。事实上，研究已经表明，vNAR结构域可以靶向酶或者裂缝的活性部位。我们的小组最近发表了一个更为全面的综述，在IgNAR V结构域的序列水平上解决了不同类型的IgNAR V域以及其产生巨大的多样性的产生问题。

除了如前所述的小分子量以及最重要的结构特征，相比传统抗体结构域，其超级稳定性和耐不可逆变性使vNAR结构成为临床开发的有前景的候选物。已经成功地表明，存在多种机会对vNAR结构域进行重构和工程化，包括单体，二聚体和三聚体构建体以及基于Fc的形式，清楚地表明了利用这些分子用于多种不同应用的可能性。因此，针对广泛的疾病相关抗原如病毒，毒素，细胞因子以及涉及肿瘤和炎症相关的靶点特异性的vNAR分子已经被分离。总而言之，当需要更高的亲和力，多种方法已经被建立以用于分离的抗原结合分子的亲和力的优化。

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然而，与已经在早期临床试验中被证明成功的骆驼的VHHs不同，用于临床应用的vNAR域的研发进展正处于早期阶段。可能部分原因可解释为，与具有哺乳动物可变结构域的鲨鱼vNAR结构域的低同源性以及由此产生的潜在的免疫原性。IgNAR V结构域与哺乳动物的VH区域的序列同源性低至25%。根据Kovalenko等描述，即使在鲨鱼vNAR结构域人源化以后，大量的非CDR残基仍然是非人源的。与此相反，VHHs与人VH的序列同源性非常高，仅仅有10个氨基酸的差别，业已证明，VHHs的人源化可以很简单的通过loop grafting获得。

尽管如此，已知即使人源化和完全人的抗体，例如阿达木单抗也能够显着诱导免疫原性，基本上证明需要对每个单独的治疗候选物进行检查，这些蛋白质如何在注射到患者在临床试验范围内。

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鲨鱼VNARs天然库库容量不大，多样性受限，但是也能得到抗原特异性的VNARs.天然库没有免疫个过程，构建很快，并且花费少。
为了获得大容量的天然库，需要从多个动物中取样。
但是，和免疫库比较，天然库得到的抗体亲和力较低。
得到高亲和力，抗原特异性的VNAR，更多研究团队还是选择进行免疫。

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作者团队在1999/2000年开始研究VNARs时，因为VNARs的体积小，长期进化下蛋白稳定性好，专注于他们潜在的生物技术应用研究。
斑纹须鲨是我们的本土物种之一，作者他们将斑纹须鲨的II型基因构建为表达载体，和单域抗体，Fab，Scfv等进行比较，检测其表达，纯化，和稳定性，结果比较理想。
此后，VNARs的表达和噬菌体抗体展示载体结合起来，利用pFAB5c载体，对VNARs进行周质表达。

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VNAR抗体表位的结构明显不同于传统抗体。
更适合结合隐藏的凹形裂缝，热稳定性增强，高亲和性。
尽管缺失CDR2区，VNARs通过延长CDR3区获得更多的多样性，通过环间和环内的二硫键使得延长的CDR3区形成灵活的指状伸出结构，增加稳定性。各型的VNAR能形成典型的凸型抗原结合位点，非常适合和难以接近的抗原蛋白裂缝区和洞穴结构进行结合。
利用这一特性，得到一些难以处理的抗原表位，如酶活性位点和寄生虫胞外区域的VNAR。
传统抗体在形成可变区的界面，需要有保守的疏水残基。
在VNARs中，抗体-抗原结合区域缺乏疏水残基，而是极性残基增加其可溶性。
VNAR表现出较高的热稳定性和再折叠能力，和抗原形成高度结合亲和力(达到皮摩尔到低纳摩尔水平)，无需再有亲和成熟的要求。

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免疫文库和合成文库比，库容量更小，因为针对特异性抗原，在动物体内抗体会经过一个亲和力成熟的过程，因此免疫文库经过几轮扩增和筛选，更容易得到高亲和力的抗体。
VNARs还有一个被忽视的优点是，针对人和哺乳动物的高度保守蛋白质，鲨鱼免疫更容易产生免疫性IgNAR抗体。

经过四亿五千万年，弹性鳃目动物和人类之间存在的进化差异，使得哺乳动物的蛋白质被鲨鱼视为“外来的”抗原。只是鲨鱼免疫过程需要4-6个月，并且需要定制特殊的试剂进行鲨鱼抗体滴度的鉴定。
鲨鱼针对抗原产生的IgNAR比 IgM和IgG要慢。 在脊椎动物进化的早期，产生特定体液反应和随后在体内成熟的能力显然就存在了。而IgNARs作为一个亲和成熟的配体，，专门用来识别蛋白质空洞或峡谷结构。