蛋白质与酶工程

傲慢与偏见

张德华主编

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第一章 绪论
第一节 蛋白质工程的物质基础
蛋白质工程：以蛋白质的结构与功能的关系研究为基础，利用基因工程技术或化学修饰技术对现有蛋白质加以改造，组建成新型蛋白质的现代生物技术。
蛋白质工程的操作对象是基因。
蛋白质工程所需的蛋白质主要来源有自然来源和人工合成：
自然来源：主要取自微生物，植物和动物
人工合成：化学合成。

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从微生物中提取蛋白质：
要求微生物菌必须是非病原的，非毒性的，并且不产生抗生素。
优点：生长周期短，容易遗传操作，可以产生胞外酶，提纯工艺简单。
1. 基因工程菌生产蛋白质
主要目的是提高内源微生物蛋白的产量，方法有：
① 将相关基因的附加拷贝引入微生物；
② 将相关基因的一个拷贝或多拷贝引入微生物，在强启动子下控制表达，该法能成倍提高目的蛋白的产量。
如：脂肪酶洗涤剂和植酸酶

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2. 大肠杆菌生产异源蛋白
生产异源蛋白的细菌中最常见的是大肠杆菌。
由大肠杆菌天然合成的蛋白质大多数存在于细胞中，只有很少被分泌到细胞周质中，还有少部分分泌到培养基中。
产生异源蛋白的缺点：
① 多以包涵体形式在细胞内聚集；
② 不能进行蛋白质翻译后修饰：如糖基化，酰胺化，或乙酰基化；

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在多数情况下，这些蛋白质聚集在细胞质内，形成不溶性聚集体，即包涵体。
包涵体是一种无膜包被的蛋白质不溶性聚集体，包括目的蛋白，菌体蛋白等
包涵体的一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以多数没有生物活性。
包涵体的主要成分是异源蛋白，（其中其他蛋白含量低于15%，主要是RNA聚合酶），大肠杆菌外膜蛋白和rRNA组成。
包涵体形成原因：
① 蛋白过量聚集，超过溶解度，导致沉淀；
② 蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；
③ 蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀；
④ 表达蛋白过多，与其结合/诱导组分不足，不能形成溶解状态；
⑤ 蛋白质自身不稳定；
⑥ 没有足够的分子伴侣/折叠酶参与部分折叠中间体的聚集；
⑦ 缺乏翻译后修饰酶，产生不稳定的（真核的）异源蛋白产物。

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防止包涵体形成：
① 通过试验确定最准确的表达系统，宿主菌株，质粒和质粒拷贝数，启动子序列都影响着产品表达的水平以及产品聚积形成包涵体的趋势；
② 所需蛋白质以融合蛋白进行表达，选择宿主细胞质中高溶解性的天然蛋白质融合表达；
③ 分子伴侣共表达可提高异源蛋白的溶解度；
④ 添加辅因子，提高蛋白的溶解度；
⑤ 低于生长最适温度下培养重组细胞，如37-30℃，常可阻碍包涵体的形成。

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3.酵母菌生产异源蛋白
大多数酵母菌是安全的食品级的（GRAS），如酿酒酵母；酵母菌表达能进行翻译后修饰，酵母细胞为真核细胞，具有亚细胞器官。
不足在于：
但是异源蛋白的表达水平低，通常占细胞总蛋白的5%以下，比在大肠杆菌低很多。
主要分布在细胞周质中。并且翻译后修饰水平和类型和天然来源依旧有区别。

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真菌生产异源蛋白：
如黑曲霉，构巢曲霉
产量高，如一些工业菌株可天然生产20g/L葡糖糖化酶。

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来源于植物蛋白质：
用于特有或者易提取的蛋白质，如木瓜蛋白酶，应乐果甜蛋白，无花果蛋白酶

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动物组织作为蛋白质的来源：
许多商用蛋白质来源于动物，如胰岛素和血液因子。
① 利用转基因动物生产异源蛋白；
② 利用动物细胞培养生产异源蛋白；
生产单克隆抗体，各种疫苗，干扰素。
③ 昆虫细胞培养，如使用杆状病毒表达系统生成重组蛋白。