猪瘟病毒E2 基因噬菌体展示多肽库的构建及表位鉴定

米小圈

猪瘟病毒E2 基因噬菌体展示多肽库的构建及表位鉴定

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摘要:
目的：本研究通过建立CSFV 噬菌体展示多肽库，并对其进行生物淘选，以期获得E2 蛋白上新的抗原表位。
方法：选择CSFV 石门株(SM) 和疫苗株( HCLV) 为代表株，采用噬菌体展示技术，以T7select41521b 为载体，分别构建了CSFV SM 株和HCLV 株E2 基因噬菌体展示多肽库(SM2E2 库和HCLV2E2 库) 。通过生物淘选和噬菌体原位杂交技术，采用7 株猪瘟单克隆抗体和1 株猪瘟高免血清分别对构建的SM2E2 库和HCLV2E2 库进行抗原表位筛选。
结果：筛选到了5 条与E2 蛋白高度同源的序列，在E2 蛋白上的同源区域分别为TAVSPTTLR、YYEP、TTWKEYSH、GGQ(V) V K和PDGL PHY。
结论：TAVSPTTLR、YYEP 和TTWKEYSH 序列与目前已知E2蛋白表位一致，说明它们是E2 蛋白上的优势表位; GGQ(V) V K和PDGL PHY序列与预测表位一致，推测是E2 蛋白上潜在的抗原表位。

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背景摘要：
猪瘟病毒(Classical swine fever virus , CSFV) 引起猪的高度致死性接触性传染病。
研究探讨CSFV E2 蛋白抗原表位的分布和生物学特性对开发诊断试剂和疫苗具有重要意义。
CSFV E2 糖蛋白由370 个氨基酸残基组成，是CSFV 最不保守的区域，也是CSFV 能诱导机体产生中和抗体的主要保护性抗原区域。
噬菌体展示技术可用于抗原表位的研究，只需要以抗原的特异性单抗对肽库进行筛选，并对所筛选的重组噬菌体肽序列与抗原序列比较，找到存在于抗原肽段上的同源序列即可认为是抗原表位。
本研究通过构建的CSFV 石门株(SM) 和疫苗株( HCLV) E2 基因的噬菌体展示多肽库，利用生物淘选和噬菌体原位杂交技术，采用7株猪瘟单克隆抗体和1 株猪瘟高免血清分别对所构建的肽库进行抗原表位筛选。

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实验中所用的材料：
猪瘟石门标准强毒株( F114 ,1998. 6. 25 ,CSFV SM 株)
猪瘟兔化弱疫苗株( F479 ,1996. 3. 28 ,CSFV HCLV 株)
T7 select415-1b 载体、噬菌体包装蛋白购自Novagen 公司。
Dnase Shotgun Cleavage Kit购自Novagen 公司（现在已经查不到这个试剂盒的资料了）
p Hi nd Ⅲ接头和p EcoR Ⅰ接头
猪瘟病毒E2 7株单抗，纯化猪瘟高免血清(CSFV Ab)
离心滤器装置Microcon YM100 、Microcon YM 10 购自Millipore公司
0. 45μm 孔径的Prot ran BA85 硝酸纤维素膜(S &S 膜) 购自德国Schleicher &Schuell 公司

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两种病毒E2 片段的DNase Ⅰ的随机酶切及20～125 bp酶切片段的获得
提取两株病毒的基因组RNA，反转录得到cDNA。
用两对特异引物，采用套式PCR进行扩增
P1-1:ATCAACCACGGCATTCCTCATCTG
P1-2:CAACCGCCATCTATCTTTCCACCCT
以CSFV病毒株cDNA为模板，扩增得到1625bp的片段

P2-1: CAAGGCCGGCTAGCCTGCAA
P2-2: TGGTAGACCAGCGGCGAGT
以上一轮PCR产物为模板，扩增得到1125bp的片段，即为E2基因除了信号肽序列外的完整序列。

纯化回收SM-E2 基因和HCLV-E2基因，用Microcon YM100超滤管进行浓缩。
通过对DNase I酶切条件的优化，选择最佳条件进行DNase 酶切。

DNA片段10ug，10*DNase I buffer 0.9ul，10*氯化锰 0.9ul，DNase I 1ul，补水至10ul。
21℃作用10min，加入2ul 100mM EDTA，70℃保温10min，灭活酶。

将酶切的随机片段用Microcon YM10，Microcon YM100滤器过滤，得到SM-E2 、HCLV-E2 的20～125 bp 酶切片段。

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SM-E2 、HCLV-E2 酶切片段的修饰
1 T4 DNA 聚合酶的作用下补平为平末端
反应体系：DNA酶切片段 10ul，NEB buffer 2 2ul，dNTP(10mM）1ul，BSA(10mg/ML) 1ul，T4 DNA聚合酶 5.8ul，补水至20ul。
12℃温育15min，反应结束后，加终浓度为10mM的EDTA，75℃下温育20min终止反应。
补平后DNA片段用Microcon YM10过滤管进行浓缩，纯化。


2 补平后DNA片段的去磷酸化
反应体系：补平后DNA片段11.5ul，10*热敏磷酸化酶Buffer 1.5ul，热敏磷酸化酶 2ul
37℃温育15min去磷酸化，反应结束后，65℃下温育5min终止反应。


3. 去磷酸化后的DNA片段两端加接头
商品化的pHINDIII和pEcoRI接头用TE缓冲液调浓度至50pmol/ul，70℃保温10min，缓慢退火，-20℃保存。
反应体系：去磷酸化后的DNA片段 13ul，两个接头各2ul，10*T4DNA连接酶buffer 2ul，T4DNA连接酶 1ul，补水至20ul。
16℃连接过夜，反应结束后，65℃下温育10min终止反应，4℃保存备用。


4. 双酶切处理E2修饰后片段，和载体T7select415-1b并且分别进行连接
双酶切后E2混合短DNA片段用Microcon YM10过滤管进行浓缩，纯化。
双酶切处理后载体用胶回收试剂盒回收。

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噬菌体的体外包装及原库的构建
SM-E2 和HCLV-E2 酶切片段分别与T7 select415-1b 载体连接，并将连接产物直接与T7 包装提取物于22 ℃温育2 h 进行体外包装，加入270 μL LB 培养基终止反应，4 ℃保存备用（一周内使用）即构建获得SM2E2 、HCLV2E2 噬菌体原库。

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原库滴度测定：(1) 接种一定量的BL21于M9TB/M9LB培养基中，于37℃200pm培养至OD＝1。4℃保存备用(4℃保存不能超过48小时)。

M9TB/M9LB培养基：20*M9盐溶液5ml，20%葡萄糖 2ml，1M 硫酸镁溶液0.1ml，TB/LB溶液 93ml。
20*M9盐溶液：七水磷酸氢二钠 256g，磷酸氢钾 60g，氯化钠 10g，氯化铵 20g，补水定容终体积1L。高压灭菌。

(2) 按照每个平板5mL的量熔化一定量的上层琼脂糖胶，将熔化好的上层琼脂糖胶保温于45～50℃备用。
上层琼脂糖配方：100ml去离子水中加蛋白胨1g，酵母提取物 0.5g，Nacl 0.5g，琼脂糖0.6g，高压灭菌。

(3) 用LB或TB培养基进行重组噬菌体的连续的10倍梯度稀释：加10uL重组噬菌体于990uL的培养基中，混匀，即得到100倍稀释的菌体；取100uL的100倍稀释的噬菌体加于900uL的培养基中，混匀，即得到1000倍稀释的噬菌体。按照同样的方法将噬菌体稀释至10000和100000倍。

(4）在5mL无菌离心管中加入250L的BL21宿主菌，按照从高到低稀释倍数加入100L.重组菌体稀释液。

(5) 向每个离心管中再加入3mL保温的上层琼脂糖胶，立即混匀并将所有混合物倒入37℃预热的固体LB平板中，立即旋转平板使上层琼脂均匀平铺于平板中，水平放置冷却。

(6) 数分钟后，待上层琼脂糖胶凝固后，倒置平板于37℃温箱培养3～4小时或者室温过夜培养。

(7) 菌斑的计数和滴度的测定:对不同稀释倍数下的平板上的菌斑进行计数，据此计算ME2、HCLV-E2原库的滴度

噬菌班肉眼可见，计数后计算噬菌体滴度：

样品滴度（pfu/ML）=噬菌班个数*稀释倍数*噬菌体用量
噬菌体的总个数=样品滴度*样品总体积

经计算，SM-E2 噬菌体原库PFU 与HCLV-E2噬菌体原库PFU 分别为6. 6 ×10^5 和3. 2 ×10^5;

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原库的扩增
(1) 无菌接种1mL BL21宿主菌于50mLTB培养基中，于37℃200pm培养至OD＝06～10TB培养基的配制：900ml水中加入胰蛋白胨 12g，酵母提取物 24g，甘油4ml，高压灭菌。
液体冷却到60℃时，加入100ml无菌的0.17M 磷酸二氢钾+0.72M 磷酸氢二钾溶液。
无菌的0.17M 磷酸二氢钾+0.72M 磷酸氢二钾溶液：90ml去离子水加2.31磷酸二氢钾+12.54磷酸氢二钾，完全溶解后定容到100ml，高压灭菌。
（摘自分子克隆第三版）

(2) 按照10^6个噬菌体/10mL宿主菌的浓度计算扩增原库所需要的宿主菌的量。将原库中的菌体加入到相应数量的宿主菌中混匀，在20min内铺板。

(3) 转移1mL的噬菌体/BL21宿主菌混合物于无菌的15mL离心管，加入10mL保温于45～50℃的已熔化的上层琼脂糖凝胶，立即混匀并将所有混合物倒入37℃预热的150mm固体LB平板中，立即旋转平板使琼脂均匀平铺，水平放置冷却。
(4) 数分钟后，等上层琼脂糖胶凝固后，倒置平板于37℃温箱培养3～4小时或者室温过夜培养。

(5) 每块平板加入10mL噬菌体提取缓冲液，4℃水平放置2小时或过夜。
噬菌体提取缓冲液的配制：20mM TriS-HCL， PH8.0，100 mM NaCL，6 mM硫酸镁

(6) 轻敲平板并反复吸后，将上清转移至无菌50m1离心管，加入0.5mL氯仿/10mL上清，轻轻混匀后，300g离心5min，将上清转移到另一无菌50m离心管中，4℃可以保存几个月，长期保存需要加入0.1体积的80％的灭菌甘油，-70℃保存。



SM-E2 和HCLV-E2 噬菌体扩增库的滴度分别为5. 4 ×10^10 和3. 58 ×10^10 。

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生物淘选

1. 抗体的包被
(1) 用包被液将抗体稀释成终浓度为100μg/mL。加入ELISA板中，每孔100ul，4℃包被过夜。
包被液（0.05M ph=9.6）的配制：1L水中加入1.59g碳酸钠，2.93g碳酸氢钠。
(2) 用300ul的TBS洗涤包被板3次，除去没有结合的蛋白。
10*TBS的配制：700ml去离子水中加入80g氯化钠，2g氯化钾，30gTris，用Hcl调至ph至7.4，用去离子水定容至1L。使用时稀释10倍。
(3) 脱脂奶粉溶于TBST中配制成5%的封闭液，每孔加300ul，4℃封闭过夜。
TBST的配制：在100ml的1*TBS液体中加入50ulTween-20。
(4) 用300ul的TBS洗涤包被板3次，每孔加入300ul去离子水，用封口袋密封后，4℃保存备用。

2. 噬菌体的第一轮淘选
(1) 无菌接种1mLBL21宿主菌加到 50ml.LB培养基中，37℃，220rpm培养至OD=0.6～1.0，4℃保存备用。(2) 取适量的文库液菌体于TBST中，加入包被抗体的 ELISA板中，100uL/孔，室温放置30min。
(3) 用300uL TBST洗涤ELISA板10次，每孔加入200uLT7噬菌体洗脱缓冲液，室温放置10～20min。
T7噬菌体洗脱缓冲液的配制：10mM Tris，1%SDS，ph=7.2
(4) 将洗脱下来的噬菌体转到1.5ml离心管中，重复孔可收集到同一管中。
(5) 加入250L洗脱的菌体于(1)中培养好的BL21宿主菌中进行扩增，37℃，220rpm培养直到菌液变清亮为止(3～4h)
(6) 转移裂解的菌液至50mL离心管中，8000g离心10min，将上清转移到灭菌离心管中，4℃保存备用。
(7) 将剩下的洗脱噬菌体和扩增噬菌体进行滴度的测定。
完成第1 轮淘选后，计算淘选产率，产率的计算公式:产率（Yield）= 产出量（Output）/投入量（Input）×100 %。

3. 菌体的第二、三、四轮淘选按照上述的步骤在进行第二、三、四轮淘选，在第二、三、四轮淘选的过程中各抗体的包被浓度依次为:30 ug/ml、10ug/mL、10ug/mL。

经过四轮淘选，具有强亲合力的噬菌体被逐渐扩增富集，产率逐轮增加，可达10^-2。并且多抗对噬菌体的富集产率明显高于单克隆抗体。