Potent Neutralization Ability of a Human Monoclonal Antibody

潇湘妃

Potent Neutralization Ability of a Human Monoclonal Antibody Against Serotype 1 Dengue Virus

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摘要：

目的：在热带和亚热带地区，登革病毒感染逐年上升，但是针对登革病毒感染的防治药物仍然匮乏。

方法：采集恢复期登革热患者外周血，分离单B淋巴细胞，获得一株DENV-1特异性单抗1G5。

结果：1G5对DENV-1的结合能力很强，针对DENV-2有一些中和活性，和3，4型不结合。1G5抗体和完整的DENV-1病毒颗粒的E蛋白结合（ELISA或者WB检测均为阳性），但是不和重组E蛋白结合，另外低浓度的1G5抗体在病毒吸附细胞前后阶段都能起到中和作用。动物实验显示1G5抗体能对病毒攻击小鼠起到保护作用，另外，抗体的突变株1G5-LALA以及1G5-9del（Fc段缺失9个氨基酸)能完全消除降低登革的抗体依赖性感染增强作用。

结论：人源性抗体1G5能对DENV-1感染起到有效的预防和治疗效果。

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背景资料 摘选
登革病毒，属于黄热病毒属，DENV病毒基因组为正链RNA病毒，11kb左右，是一种重要的蚊媒传染病病毒。
病毒基因组和多拷贝的衣壳蛋白C共同构成核衣壳，核衣壳外部包有脂双层膜，镶嵌着180个糖基化的M蛋白和E蛋白。
E蛋白晶体结构分析显示包括三个区域，DI，DII，DIII 。

近几十年，DENV感染率在世界范围在不断升高。每年约有4亿人感染。死亡数有20000。
在中国南方，DENV感染也形成了重要的威胁，2014年，有46864例病例，6人死亡。
赛诺菲-巴斯德研制的Dengvaxia于2015年获批，成为全球首个登革热疫苗产品，这款疫苗是基于嵌合型黄热病毒-DENV构建的四价疫苗。目前在一些国家内得以使用。
但是这个疫苗作为一种活病毒，接种疫苗相当于一种沉默的自然感染，当真得被登革病毒感染时，相当于第二次感染，可能会引起更严重的疾病产生，因此上市以来引起纷争不断，在菲律宾已经禁用。
治疗性抗体是一种有前景的针对感染性疾病的预防和治疗手段。
Palivizumab是一只非常成功的针对病毒感染的人源化的鼠单克隆抗体，该药通过呼吸道合胞病毒融合蛋白阻止病毒向下呼吸道扩散。1998年获得FDA批准用于预防不足35周早产儿的先天性心脏病或肺部疾病。
关于登革病毒，已报道的型特异性抗体对病毒有很强的中和活性，被动免疫小鼠后对病毒攻击能产生一定的保护能力。
本研究中对2014年广州DENV患者的血液，运用FACS分选单B细胞，通过单细胞PCR扩增抗体轻重链基因，筛选人源性DENV单抗，最终获得一株抗体1G5.

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实验中使用的细胞和病毒
C6/36，K562，BHK-21，293 细胞。（K562细胞用于进行ADE活性检测）
DENV-1 GE27株, DENV-2 New Guinea C (NGC) 株，DENV-3 YN01株，DENV-4 30株。
病毒在细胞放大培养后，2000g离心，去除细胞碎片，收集上清，-80℃保存。

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外周血单核淋巴细胞分离
三名确诊为登革热的患者，中和抗体监测DENV-1阳性，发病后第15/16天采集外周血血样。
Ficoll密度梯度离心法分离PBMCs。
用 FITC标记的鼠抗人CD3 (555332, BD Pharmingen), APC标记鼠抗人CD19(555415, BD Pharmingen), FITC标记鼠抗人CD20(555622, BD Pharmingen), PE标记鼠抗人CD27 (555441,BD Pharmingen), PE-CyTM7标记鼠抗人CD38(560677, BD Pharmingen)抗体
选用CD3，CD19，CD20，CD27，CD38五种淋巴细胞表面分子标志用于流式细胞术分选B细胞。
目标细胞为CD19high/CD3negative /CD20low to negative/ CD27high /CD38high
将获得的目标细胞按单个分到含有RNase抑制剂的96孔PCR板中。
最终2*10^6的PBMCs细胞中分离出1056个单个抗体分泌细胞。

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获得人源性抗体
以流式分选获得的单个B细胞为模板，通过RT-PCR 和巢式PCR两步获取抗体可变区基因。
使用下表中抗体轻重链基因的混合引物，一步法RT-PCR获得单个细胞内抗体轻重链基因。

分别使用下表中抗体重链，轻链（k/ λ）引物进行巢式PCR扩增。
1056个单B细胞中一共有285个同时扩增出重链和轻链，PCR扩增产物约350–400bp。
利用PCR两端得Sal-I和Pml-I双酶切位点，将该片段插入到已有抗体恒定区的质粒载体pTSEG1n（插入重链可变区）, pTSEK或者 pTSEL（插入轻链可变区）中。成对的质粒转染293细胞，四天后收上清，用HiTrap MabSelect Xtra柱纯化抗体。
用灭活的DENV病毒作为抗原包被ELISA板，筛选到88株抗体和DENV特异性结合。

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筛选针对DENV-1的中和抗体
对88株和DENV-1特异性结合的抗体进行了针对DENV-1的中和抗体的检测。
实验标准步骤：1. 实验前一天准备BHK-21细胞，调整密度到5*10^5/ml，接种到六孔板中，每孔2ml，37℃过夜培养。
2. 抗体浓度调整到20ug/ML，和100pfu的DENV-1病毒等体积（各100ul）混合，同时设置无抗体对照，37℃孵育1小时。
3. 取出六孔板，弃去培养基，加入无血清培养基800ul。
4. 病毒和抗体混合物加入到六孔板中，37℃孵育1小时。
5. 吸去培养基，PBS清洗两遍，按2ml/孔加半固体病毒培养基[1.0% (w/v) 低熔点琼脂糖 (0815, Amresco)，溶于含 2% (v/v) FBS的DMEM中]，37℃孵育4-5天，直至细胞出现明显病变。
6. 培养板每孔加入1ml 4%多聚甲醛，4℃固定1小时，去除所有覆盖物，每孔加入1ml 1%结晶紫溶液，室温染色30min，用离子水冲洗干净。
7.计数空斑数，计算抗体对DENV-1病毒的抑制率。
抑制率=（对照组空斑数-实验组空斑数）/对照组空斑数*100%

结果有24株抗体可以中和50%以上的登革病毒，75%以上的有12株，接近或者达到100%的有4株（其中一个即为1G5).

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WB检测1G5抗体血清型特异性并确定其结合蛋白
所用到抗体：
1G5，本研究中筛选到的抗体。
DV69.6抗体, 针对DENV prM蛋白的交叉反应型抗体；
4G2抗体，黄热病毒属针对E蛋白融合环的交叉反应型抗体。
病毒来源：病毒感染细胞后上清，4型病毒活病毒

lanes 1–3, 7, 11, DENV-1; lanes 4, 8, 12, DENV-2; lanes 5, 9, 13, DENV-3; lanes 6, 10, 14, DENV-4.
lane 1-6 非还原/非变性蛋白电泳
lane 1, DV69.6抗体, 和DENV-1型病毒 prM蛋白结合
lane 2, 4G2抗体, 和DENV-1型病毒 E蛋白结合
lane 3，1G5抗体, 能和DENV-1型病毒 E蛋白结合
lane 4，1G5抗体, 能和DENV-2型病毒 E蛋白结合
lane 5，1G5抗体, 不能和DENV-3型病毒结合
lane 6，1G5抗体, 不能和DENV-4型病毒结合
lane 7-10 还原/变性蛋白电泳
lane 7，1G5抗体, 不能和DENV-1型病毒结合
lane 8，1G5抗体, 不能和DENV-2型病毒结合
lane 9，1G5抗体, 不能和DENV-3型病毒结合
lane 10，1G5抗体, 不能和DENV-4型病毒结合
lane 11-14 非还原/非变性蛋白电泳
lane 11，4G2抗体, 能和DENV-1型病毒 E蛋白结合
lane 12，4G2抗体, 能和DENV-2型病毒 E蛋白结合
lane 13，4G2抗体, 能和DENV-3型病毒 E蛋白结合
lane 14，4G2抗体, 能和DENV-4型病毒 E蛋白结合

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ELISA 实验对1G5进行抗体亲和力分析
用两种抗原进行包被
1. 黄热病毒属E蛋白特异性抗体4G2，200ng/孔。封闭后加入四种血清型登革病毒。
2. 原核表达的四型登革病毒的重组E蛋白，200ng/孔。
一抗为HMAb 1G5（初始浓度为30 ug/ml，3倍倍比稀释，至最低浓度0.17ng/ml）。
HMAb 6B1，能识别四型登革病毒的E蛋白，作为阳性对照。
HMAb S4B11，PDL-1单抗，作为阴性对照。
二抗为HRP-山羊抗人 IgG。

(B) ELISA实验检测HMAb 1G5和四型登革病毒结合能力，包被4G2抗原后，加入四种血清型登革病毒，显示和DENV-1结合。


(C) ELISA实验检测HMAb 1G5和四型登革病毒的E蛋白结合能力，包被四型病毒的E蛋白，显示和四型病毒E蛋白均不结合。
(D) ELISA实验检测阴性对照HMAb S4B11和四型登革病毒的E蛋白结合能力，包被四型病毒的E蛋白，显示和四型病毒E蛋白均不结合。
(E) ELISA实验检测阳性对照HMAb 6B1和四型登革病毒的E蛋白结合能力，包被四型病毒的E蛋白，显示和四型病毒E蛋白均能结合。

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HMAb 1G5对病毒吸附前后的感染抑制实验：
用BHK-21细胞对HMAb 1G5抗体进行噬斑减少中和实验(PRNT)，结果（图A）显示和DENV-1，DENV-2有很强的中和活性，针对DENV-1，DENV-2的PRNT50分别为0.07 ug/ml和13.84ug/ml。

E蛋白在病毒生命周期中的吸附和与宿主细胞融合这两个过程中都发挥重要作用，靶向E蛋白的中和抗体可能通过干扰这两个过程来阻断病毒感染。
通过对病毒吸附前后的感染抑制实验来判断HMAb 1G5在哪个环节中影响抗体对病毒感染产生的阻断作用。
结果（图B）显示，吸附前后的PRNT50分别为1.08 ug/ml和0.85 ug/ml，说明中和抗体HMAb 1G5在病毒吸附后阶段通过干扰病毒感染来发挥中和作用。