Rapid Construction of a Replication-Competent Infectious Clone of Human A

傲慢与偏见

Rapid Construction of a Replication-Competent Infectious Clone of Human Adenovirus Type 14 by Gibson Assembly

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摘  要　
目的：HAdV14引起的急性呼吸道疾病（ARD）在世界多地频频爆发。构建新的基因突变型HAdV14全长感染性克隆，为后续研究打基础。
方法：采用一步Gibson Assembly方法，得到HADV-B14p1病毒GZ01株一个全长的感染性克隆质粒pBRADv14。转染A549细胞获得重组病毒。
结果：全长感染性克隆质粒pBRADv14经过PCR，酶切鉴定，测序，证实和母株序列一致，没有核苷酸突变。pBRADv14具有感染性，转染后再盲传几代能获得重组病毒。电镜下可见病毒颗粒，荧光定量PCR检测到重组病毒和野生型病毒的复制和再生能力相似。
结论：HADV-B14p1病毒GZ01株感染性克隆的构建为HADv14疫苗的研制，抗病毒药物的开发奠定基础。同时也为其他大基因组DNA病毒感染性克隆的构建提供新方案和借鉴。

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背景资料
腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的直径为70～90 nm的颗粒，基因组为线状双链DNA分子，35-40kb。
目前为止，鉴定有90种基因型，分属于A-G七个亚属。其中，前51种按照血清中和实验和红血球凝聚抑制实验进行分型，52型之后的病毒按照全长基因组序列进行分型。不过现在前51种血清型的病毒基因组也都完成全长测序。
HAdV-B14属于B2亚型成员，能导致呼吸系统疾病。1955年，首次在荷兰军队ARD患者体内发现，其后经过约50年的沉寂，其变异株HAdVB14p1重新在美国，英国，加拿大，中国等多地出现。
Gibson assembly技术是一种简单快速，不依赖酶切位点的DNA定向克隆技术，可将待插入DNA片段定向克隆至载体的任意位点。
本文中将Gibson assembly技术用于构建HAdVB14p1的感染性克隆快捷有效，成功获得稳定的感染性克隆质粒pBRADv14。为后续对该病毒的生物学特性，致病性，疫苗开发等等研究带来了方便。

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主要试剂和材料
A549细胞(ATCC: CCL-185)，DH-5a感受态，质粒pBR322
HAdV-B14病毒株（从2010年一个17月大扁桃体炎患儿体内分离，广州，GenBank accession no. JQ824845）
Q5 DNA 聚合酶， T5 核酸外切酶，Phusion DNA聚合酶， Taq DNA连接酶。（NEB有试剂盒） HAdVs的荧光定量PCR试剂盒
FITC-标记 HAdV-14 单抗 (5F11，抗六邻体蛋白)
Gibson Assembly反应液配方：

100mM NAD量可能应该为300ul

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Gibson Assembly方法构建HAdV14的感染性克隆
1 A549细胞上培养病毒，提取病毒基因组DNA。
2 EcoR I单切pBR322质粒，以此线性化质粒为模板，pBR-ITR-F/pBR-ITR-R为引物，用Q5 DNA聚合酶扩增出一4453bp大小的条带。Dpn I酶消除掉PCR产物中残余的质粒模板。（PCR序列见附件）
调整两种DNA片段为100ng/uL
腺病毒基因组加4uL。pBR322质粒PCR产物1uL，assembly master mixture加15uL，混匀，50℃孵育1小时，转化DH-5a感受态。

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腺病毒基因组比较特殊，其两末端正好为反向重复序列，用Gibson组装的方法构建感染性克隆理论上会得到两种形式的质粒，电子克隆见附件（腺病毒基因组序列 GenBank accession no. JQ824845）。在构建电子克隆的时候，我们发现按照文献中提供的引物，鉴定感染性克隆时扩增出的PCR产物大小和文献中报道不一致。

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接5楼，Gibson组装产物转化DH-5a之后，挑选到12个菌落，通过pBR-ad14-1-F/pBR-ad14-1-R和pBR-ad14-2-F/pBR-ad14-2-R两组PCR鉴定，得到3个阳性克隆，进一步将三个克隆用HVR-F/HVR-R，Fiber-F/ Fiber -R，Penton-F/Penton-R三组PCR进行鉴定。

得到的感染性克隆pBRADv14，用AsiS I进行双切，释放出HAdV14基因组，转染A549细胞，96小时后收获上清，反复冻融几次释放病毒，再次感染A549细胞，96小时后收获上清，经过两轮盲传，可以观察到明显的CPE，收病毒，-80℃冻存。

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用Vector NTI 11.5.1 软件分析感染性克隆质粒pBRADv14和提取的重组病毒rBRADv14基因组，实际酶切图谱和软件分析结果基本一致。

A，C分别是质粒pBRADv14的软件分析图谱和实际酶切结果
B，D分别是重组病毒rBRADv14基因组的软件分析图谱和实际酶切结果

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重组病毒rBRADv14和野生株GZ01病毒10倍系列稀释后感染A549细胞，40小时后能观察到CPE，用FITC-抗六邻体蛋白单抗5F11进行直接免疫荧光，监测病毒复制和六邻体蛋白的表达情况，结果重组病毒和野生病毒都检测到阳性信号，对照细胞无荧光。AB为野生株GZ01病毒感染A549细胞组
CD为重组病毒rBRADv14感染A549细胞组
EF为空白对照组
（文中未标明图片中结果是哪个稀释度的病毒）

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实时定量PCR评价rHAdV14，和野生型病毒GZ01的DNA复制能力，按MOI=0.02将病毒感染细胞，12 h, 24 h, 36 h，48 h,60 h, 72 h，84h，96h检测病毒的拷贝数，MxPro Q-PCR Software软件分析实验结果。每个时间点采集的病毒样品用荧光形成实验来估算病毒的滴度(FFU)/ml，GraphPad Prism 5绘制病毒一步生长曲线。
A 为两种病毒的实时定量PCR结果，高度相似，说明病毒的DNA基因组复制能力相似。
B 为荧光形成实验来估算病毒的滴度(FFU)/ml，非常接近，如图比较病毒再生能力，重组病毒略低于野生病毒。不过文中讨论部分提到，重组病毒经过在A549细胞中多次传代，重组病毒再生能力会得到提高。