Rapid method for the isolation of full length adenoviral genomes by bacterial

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Rapid method for the isolation of full length adenoviral genomes by bacterial intermolecular homologous recombination

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摘要：
重组腺病毒广泛用于基因治疗研究。
野生型基因组用于载体构建时可以删除部分基因（如E1基因）提高载体的安全性。本研究中建立的构建全长腺病毒基因组的感染性克隆有利于进行病毒的纯化，挑选单克隆。
利用同源重组技术获得全长克隆，得到克隆后转染细胞获得单一的病毒颗粒，而不用再进行繁琐的噬斑纯化法或者有限稀释法。

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背景摘要：
分子内同源重组已经用于较大质粒的构建，重组腺病毒构建，HSV粘粒的构建。
BJ5183细菌依赖细菌中 RecF 途径的recBC, sbcBC。
将两个在两端有≥50bp同源序列的线性DNA分子，转化进入BJ5183细菌，通过同源重组完成大质粒的构建。
腺病毒载体的构建需要：
一个质粒分子（被称作拯救质粒），质粒骨架上需要包含复制原点，抗生素基因，腺病毒左边和右边的ITR序列。
一个提取的腺病毒全长基因组分子。
两个线性片段可以是平端，也可以是不太长的粘末端（酶切位点）。
不需要磷酸化处理。
两者共转化后，可产生上百个菌落，从而筛选到阳性克隆。

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实验材料：
NEB的限制性内切酶。两种线性DNA来自：
① 病毒基因组DNA
第17/19代的重组腺病毒，高代次的腺病毒，纯度不够好。提取其混合的DNA基因组。重组腺病毒基因组的骨架是删除了E1和E3基因的HAdV5腺病毒载体，E1删除区插入了一段3500bp的转入基因。
② 线性化的骨架载体
删除了E1和E3基因的HADV质粒载体用Xba I和Avr II双切，回收2885bp的片段，这段序列包括AMP抗性基因，复制原点，AD5基因左端375bp的序列，右端477bp的序列。

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100ng纯化的重组腺病毒基因组DNA

100ng骨架载体DNA，来源于商品化Ad5载体，通过Xba I 和Avr II酶切后，回收载体部分，包括Ad5基因组左侧的375bp以及右侧的477bp。

两种DNA片段通过标准酚抽提和乙醇沉淀浓缩到2-6ul的溶液中，通过化学转化BJ5183细菌感受态。挑菌提取质粒后，重新转到XL-1菌中，再次提取质粒，进行酶切鉴定。

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酶切鉴定图2A
构建的全长腺病毒基因组质粒其基因组来自培养19代的重组腺病毒颗粒。
对18个重组质粒进行酶切鉴定，取原质粒作为对照。
结果只有13号克隆和原质粒酶切图谱一致。
其他的17个质粒酶切图谱分为四组。
并且可以分析基因组发生变化的区域主要在E1删除而插入外源基因的序列中。

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酶切鉴定图2B
构建的全长腺病毒基因组质粒其基因组来自培养17代的重组腺病毒颗粒。
对18个重组质粒进行酶切鉴定，用Pac I和Hind III进行双切，取原质粒作为对照。
结果没有和原来质粒酶切图谱一致的质粒。