An infectious West Nile Virus that expresses a GFP reporter gene

米小圈

An infectious West Nile Virus that expresses a GFP reporter gene

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摘要：
西尼罗脑炎病毒是一种蚊虫传播，在人和动物中能引起脑炎的嗜神经性黄热性病毒。1999年首先发现在西半球，迅速传播到北美，是一个很重要的致病原。
方法：本研究中，构建了编码GFP报告基因的西尼罗脑炎病毒的DNA感染性克隆(pWNII-GFP)。
结果：转染pWNII-GFP进入细胞后能产生表达GFP的WNV病毒，感染多种细胞（如神经细胞或者树突细胞），能获得高滴度的病毒 。用单抗和IFN-β可以抑制病毒的产生，说明用该系统可以用于新的抑制剂或者治疗方案的筛，在基因组中插入报告基因后病毒复制能力降低。
结论：带有报告基因的病毒颗粒能为研究WNV感染和抑制提供新的研究方案。

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背景资料：
西尼罗脑炎病毒是一种蚊虫传播，在人和动物中能引起脑炎的嗜神经性黄热性病毒，病毒颗粒为50nm左右。
WNV通过病毒E蛋白和细胞受体结合进入细胞，在感染细胞的胞浆内，11kb的正链RNA病毒翻译成一个大的多肽蛋白，进一步被细胞和病毒蛋白切割为3个结构蛋白和7个非结构蛋白。
基因组两段的非编码区域参与有效的翻译和基因组RNA的复制。
WNV主要流行于非洲，欧洲，亚洲和中东，1999年出现在西半球，纽约有59例临床报道，迅速在北美传播，2003年有9000多人被感染，2004年，美国有大约2470个实验室确诊病例，其中88例死亡。
对于WNV的嗜性和致病性尚不了解，已观察到病毒具有嗜神经性和嗜内脏性。WNV病毒对很多细胞都有感染能力。目前尚无有效的治疗方法和疫苗。
目前的研究缺乏一个能用于寻找病毒的嗜性和致病性的病毒决定簇的快速有效的方法。
本研究中，构建了一个带有GFP报告基因的感染性克隆，GFP插入到3-UTR区，受EMCV的IRES翻译调控。
转染该质粒能在很多类型的细胞中获得GFP高表达的拯救病毒，比如原代小鼠神经元细胞，人类单树突细胞等等。
表达GFP的WNV病毒为WNV的研究提供了一个方便有效的新工具和方法。

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所用到的实验材料
WNV病毒株为956 D117 3B，已构建RNA-based的感染性克隆SP6WN/Xba
HEK-293T细胞，转染感染性克隆后四小时需要用低糖培养基进行培养。
病毒颗粒收集时用0.45UM滤管进行分离纯化，长时间冻存，可以混入等体积含有50mM HEPES的FCS，-80℃冻存。
病毒滴度用BHK-21细胞上噬斑实验进行计算。

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SP6WN/Xba质粒是一个RNA-based的WNV感染性克隆，受SP6启动子调控。该质粒选用的WNV毒株为II型WNV，(Yamshchikov et al., 2001a，2001b)新的带有报告基因的DNA-based感染性克隆WNII-GFP (病毒株为956 D117 3B) ，是在SP6WN/Xba基础上进行改造， 第一，将用CMV启动子取代SP6启动子。第二，在3-UTR区插入GFP报告基因。选择GFP报告基因因为该基因比较小，另外便于观察。在载体改造中同时构建两类WNV报告系统，一类是编码GFP的感染性克隆，另一类为一系列的复制子载体。两类载体在构建的过程中，有一些共用的中间质粒。
构建WNV的亚基因组复制子
在 pSP6WNV-IHF 基础上构建亚基因组复制子pWrep2a-IHF，带有报告基因潮霉素B磷酸转移酶融合蛋白(Hph)，删除掉基因组中大部分的结构蛋白，加入FMDV的2A序列完成蛋白自切割。
构建表达EGFP的DNA-based感染性克隆pWNII-GFP

1.添加真核启动子

对质粒pWrep2a-IHF进行改造，为确保WNV基因组的3’端能在细胞中精确切割，在WNV cDNA3’末端加入HDV核酶序列以及SV40多聚腺苷酸信号。CMV启动子/增强子插在WNV基因组的第一个核苷酸前，确保WNV基因组RNA5’端没有冗余序列。构建得到质粒pCWrep2aH-IHF。

2. 构建表达GFP的感染性克隆

将WNV复制子载体中删除的结构蛋白基因重新插入到pCWrep2aH-IHF中，得到感染性克隆pWNII-IHF，进一步将pIRES2-GFP质粒的IRES2-EGFP片段插入到pWNII-IHF质粒中，构建带GFP报告基因的感染性克隆pWNII-GFP,pWNII-Not是去掉报告基因的感染性克隆。

在3-UTR中引入单酶切位点 NotI ，用于插入IRES-报告基因，NOT I酶切位点在WNV基因组中大的ORF终止密码子后第24个核苷酸位置处。因为黄热病毒感染性克隆比较难构建，在本研究中，选用Stbl2感受态进行重组质粒的转化，降低质粒发生基因重排的可能。
BHK-21细胞转染pSP6WNVNot和pSP6WNV-IHF 体外转录RNA产物后，检测能否产生病毒颗粒。通过这些实验选择IRES-报告基因的有效插入位点。

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转染后24小时，WNII-NOT产生的病毒滴度能达到10^6/ml，2-3天缓慢持续升高。和文献报道中的质粒转染VERO细胞后的病毒产量一致，说明添加的真核启动子以及3-UTR中的not I酶切位点对病毒的复制能力均无影响。

WNII-GFP转染细胞后病毒产量明显要低很多，第一天产量和WNVII-NOT相比较，降低了350倍，第三天才能达到10^6/ml。

将收获的病毒分别感染哺乳动物细胞和蚊虫细胞，绘制生长曲线，WNII-GFP的病毒滴度自始至终和WNVII-NOT产生的病毒之间存在10-20倍的差异。

质粒转染后病毒产生延迟，以及生长曲线中的病毒量较低都说明插入1.3kb的IRES-GFP对病毒生长有一定影响。

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流式检测报告基因GFP的表达

pWNII-Not/pWNII-GFP转染HEK-293T细胞后48小时，收集细胞以及含有病毒的上清液，流式分析EGFP表达情况。
转染 pWNII-GFP的细胞能检测到高水平的GFP表达 (%GFP positive: 95.46%; geometric mean channel fluorescence (GMCF): 320.25) (Fig. 3A).
未有转染的细胞对照或者转染pWNII-Not的细胞不表达GFP (两者的%GFP 阳性率: 0.08% 以及0.41%)
进一步鉴定pWNII-GFP转染细胞释放的病毒颗粒是否具有感染靶细胞的能力，将pWNII-GFP转染后的上清液感染BHK-21细胞，两天后流式检测GFP表达， (Fig. 3B). 在感染细胞BHK-21中，GFP 表达量非常高 (percent GFP positive: 95.55%; GMCF: 623.74)，而细胞对照或者pWNII-Not转染后上清感染的BHK21细胞检测不到GFP表达(两者的%GFP 阳性率: 0.05% 以及0.73%)。
感染Hela细胞后的间接免疫荧光也显示了同样的实验结果。(Fig. 3C)。
文章下面描述写得比较混乱，描述的是感染BHK-21细胞，图解注释也描述的是感染的BHK-21细胞。

WNII-Not感染后的细胞用间接免疫荧光检测为阳性，说明有WNV E蛋白表达，但是没有GFP表达。
WNIIGFP感染后的细胞能观察到GFP表达，间接免疫荧光也为阳性，说明有WNV表达，也有报告基因的表达。

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WNII-GFP病毒颗粒感染细胞后GFP表达的动力学曲线
感染前18-24小时，将2.5 *10^4 /孔的BHK-21细胞接种到48孔板中，每孔病毒接种量为10^5，MOI=4 。
感染后一小时，更换培养基，继续孵育，在各指定的时间点，收集细胞，用2%的多聚甲醛固定，流式分析，每个样本设2个复孔，重复5次。
最早在感染后14小时即能看到GFP表达，40小时后，达到一个很高的水平，
结合图2b可以看到，WNV的复制周期非常短，感染后14小时后能释放出病毒颗粒，在获得大量GFP表达期间，发生了多轮的WNV复制。

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体内WNII-GFP的稳定性
WNV基因组长11kb，插入的报告基因约1.3kb，增加了基因组长度，病毒复制速率相应减小。因此在病毒增殖的过程中，更容易产生一些突变株。插入的报告基因会出现缺失。根据图2B可以看到WNII-GFP复制一代需要24小时左右。
将WNII-GFP质粒转染HEK-293T细胞，24小时后测病毒滴度，以moi=0.1感染HEK-293T细胞，感染48小时后，收上清和细胞，测病毒滴度，再感染HEK-293T细胞，传4代。流式和间接免疫荧光（WNV E1.E6单抗检测）分别检测GFP和病毒E蛋白的表达，结果病毒E蛋白表达非常稳定，而GFP 骤降，到144小时以后，只有10%的细胞检测到GFP表达。

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GFP蛋白的表达逐渐减少说明报告基因表达框可能发生突变或者缺失


将BHK-21接种到12孔板中培养，按moi=0.1用WNII-GFP病毒感染细胞，在指定的时间点，收病毒提取总RNA
RT-PCR扩增IRES-GFP表达框
上游： (sense: 5’-ATTGTAGTGGAGGACACTGTTTTG-3‘)
下游： (antisense: 5‘-CTGACTTCCATTCTCAATAAATCC-3’)
电泳结果如图A，24小时，电泳条带大小1.3kb如预期，其后36小时，50小时，开始能扩增出一些小的条带，连接到载体中测序，发现读码框出现各种缺失，如图B。

结合上面的实验结果，说明：WNV基因组能够引入报告基因的插入，但是病毒复制能力也随之下降，病毒在选择压力下，不表达报告基因的重组病毒颗粒会占生长优势，越来越多，而有报告基因表达的病毒会越来越少。