Genetically delivered antibody protects against West Nile virus

米小圈

Genetically delivered antibody protects against West Nile virus

米小圈

文章摘要：
本研究制备了重组抗体Fc-9E2，包含一个IgG1 Fc段和一个针对WNV病毒的杂交瘤9E2的单链Fv段的融合蛋白，Fc-9E2保留了单抗的特异性和WNV的中和活性。通过腺病毒介导的体内运输表达该抗体基因，能够在体内血清维持Fc-9E2水平，保护动物免受致死性WNV的感染。这种利用腺病毒载体进行WNV单抗抗体基因的传递，可能是一种很好的针对感染性疾病的有效治疗手段。

米小圈

背景摘要：
1999年，西尼罗脑炎病毒传播到西半球，成为一个重要的致病原，如何控制WNV和其他黄热病毒感染，发展疫苗研究成为研究者关注的热点。
被动免疫特异性抗体或者免疫球蛋白能有效清除或者改善黄热病毒感染，在动物实验中已经得到验证。
收集病人血清，建立体外人源性抗体库筛选重组单抗是一种有效的得到治疗性或者预防性抗体的手段。
生产临床用级别的抗体用于被动免疫比较复杂，花费比较高，而Ad载体作为基因递送系统表达单抗基因在体内表达抗体可以作为治疗感染性疾病的一个手段。

用于进行抗体基因的递送载体目前有非病毒和病毒两类载体，Ad载体作为制备重组抗体的递送系统已经用于癌症，抵抗炭疽致病性毒素等的治疗。
重组腺病毒载体作为递送系统具有安全，稳定性好，操作简单，产量高，纯化简单，经济等优势。感染性疾病治愈后腺病毒载体能从机体内清除掉。

两个基因分别表达轻重链后组成抗体分子，很难在一个载体上对两个基因进行相对平衡的表达。
单链抗体为基因合成而得，一个大的表达框包括轻链，重链的可变区，中间用一段柔性肽进行连接。
重组抗体可以设计为一个单链抗体和其他蛋白的融合，如Ig的恒定区片段。一个好的有效的治疗性抗体结构中应该保留抗原结合部分以及有功能的区域部分。
Lo et al. 发表了一种能得到真核高表达重组蛋白的方法，将目的蛋白融合在Ig分子恒定区（Fc）段羧基端，对于重组抗体分子来讲，Fc段的替换可能会使抗体的功能发生重新调整改变。在本研究中，我们将一个单抗的可变区组合成单链抗体，再和IgG 的Fc段结合构建重组抗体分子，得到的重组抗体依旧保留结合活性。用Ad腺病毒载体系统进行WNV中和抗体基因在体内的递送，能高水平，持久表达保护性重组抗体，并且对小鼠一次性免疫能够有效阻止致死性WNV的感染。

米小圈

实验所需材料
WNV病毒株Vlg99-27889 (Lvov et al., 2000)，Eg101 (Melnick et al., 1951)，NY99株385–99 (Tesh et al., 2002)
腺病毒包装系统，HEK293细胞
人肺腺癌A549细胞，用于产生Fc-9E2抗体。病毒株Vlg99 WNV的E蛋白羧基端(aa 551-743, GenBank #AAP22089)表达蛋白。表达载体为 pET21（a），在BL21(DE)plysS中进行表达，用TALON 进行纯化(Clontech, Paolo Alto, CA) ，PBS透析。

米小圈

单链抗体9E2的构建
mAb 9E2单抗是针对WNV包膜蛋白产生单抗的杂交瘤细胞，单抗9E2结合表位为WNV E蛋白的DIII区，对很多株WNV病毒有很强的中和特性。
RNeasy kit (Qiagen,Valencia, CA)提取细胞总RNA，RT-PCR扩增抗体的轻链，重链可变区，PCR片段连接到噬菌粒质粒pSEX81中 (Breitling et al., 1991)，得到质粒pSEX/9E2。感染M13K07辅助噬菌体，得到一个小型的9E2单链抗体库，经过WNV E羧基端蛋白的筛选和ELISA鉴定，确认9E2单抗的轻重链核苷酸序列。
scFv 9E2 VH和VL序列参见NEBI数据库EF571851和EF571852。
重新将单链抗体序列插入到细菌表达载体pOPE101中 (Dubel et al., 1993)，蛋白带有c-myc检测标签和HIS纯化标签。

组合Fc-9E2 DNA序列：
人源Ig γ的铰链区，重链恒定区1，重链恒定区2组成Fc区(Open Biosystems, Huntsville, AL; GenBank #BC073782)， 在铰链区的Cys(248)Ser (according to AAH73782) 引入点突变，CYS和轻链的CYS形成二硫键，Fc段插入到pSecTag2a载体中，和鼠Igκ V-J2-C 信号肽序列融合。
9E2单链抗体基因和信号肽/Fc序列融合，构建得到pSecTag/Fc-9E2。
完整的表达框包括CMV启动子-Fc-9E2单链抗体-BGH多聚腺苷酸序列。
将表达框再重新克隆到穿梭质粒pShuttle中 (Stratagene, La Jolla, CA)，构建得到 pShuttle/CMV/Fc-9E2。
用AdEasy Adenoviral Vector System (Stratagene) 包装获得重组腺病毒颗粒Ad/Fc-9E2，氯化铯密度梯度进行纯化。
在293细胞上完成活病毒滴度测定，紫外分光光度计对病毒颗粒进行滴度测定，260nm，1OD=1.1 × 10^12
本研究中腺病毒制备其vp值和pfu之比为10：1。
同时，制备表达SARS刺突蛋白的G19单抗的腺病毒颗粒作为无关对照。
以MOI=100将Ad病毒颗粒感染A549细胞，37℃感染1小时，每3天换液一次，直到感染后12天，收集所有上清，用Protein A Antibody Purification Kit (Sigma, St. Louis, MO)进行纯化。产量大概为5mg/L。

米小圈

9E2重组抗体特性：
Ad5/Fc-9E2腺病毒颗粒感染A549细胞后，收集上清液进行蛋白电泳，WB检测，一抗为(HRP)标记的山羊抗人IgG Abs 。图a可见变性情况下蛋白大小约55kd，为单分子形式。非变性情况下在110kd可以看到蛋白条带，说明重组抗体为双分子形式。
间接ELISA检测 Fc-9E2和WNV病毒颗粒的结合特性，用WNV单抗5H6或者无关抗体作为捕获抗体，用WNV Eg-101株感染细胞后的裂解产物（反复冻融三次后超声）进行孵育，再加入纯化后的Fc-9E2抗体。（图b中□为以WNV单抗5H6为捕获抗体，◇为无关抗体作为捕获抗体）
另外ELISA实验用WNVEC纯化蛋白（400ng/孔）进行包被，检测和重组抗体结合活性。
以及用放射自显影方法检测Fc-9E2和WNV E蛋白（W956株病毒颗粒）之间的结合活性。
用WNV单抗mAb E31，纯化的Fc-9E2, 蛋白-A进行检测。

米小圈

中和抗体实验PRNT
体外检测Fc-9E2中和WNV的能力，Fc-9E2能有效中和WNV的NY99和EG101病毒株。

米小圈

动物实验：
雌性BALB/c 小鼠，6周龄，ip注射10^8 或者10^9 pfu Ad/Fc9E2病毒颗粒，分别在1, 2, 3, 4, 5, 7, 14，21天采血，收集血清，每个时间节点取三只小鼠处死，测血清中抗体浓度。

米小圈

动物保护实验
雌性Swiss Webster小鼠，4周龄，ip注射 Ad/Fc-9E2 or Ad/Fc-G19（无关抗体）。
腹腔注射10^9 pfu腺病毒颗粒，每种病毒设三组，分别在接种前24小时，同时接种，接种后24小时用WNVNY99 (200 pfu/mouse，10LD50)攻击，每组6只实验小鼠，空白对照组注射200 pfuNY99。监测14天，指定时间取血样，ELISA检测血清中Fc-9E2抗体以及产生的抗-WNV鼠IgM，抗原选用纯化的NY99病毒颗粒。


(a) 接种Ad/Fc-9E2前24小时用WNVNY99攻击（□），存活率为83.3% (5/6) ；接种Ad/Fc-9E2同时用WNVNY99攻击（△），以及接种Ad/Fc-9E2后24小时用WNVNY99攻击（○），小鼠全部存活。（◇）代表对照组。
用NY99病毒进行包被，ELISA检测WNV攻击后的小鼠血清中Fc-9E2的含量。见图a-c，□和◇分别代表接种Ad/Fc-9E2和Ad/Fc-G19，a-c分别代表接种前24小时，同时，以及接种后24小时用WNV攻击。

检测血清中抗-WNV IgM含量，见图d-f，□和◇分别代表接种Ad/Fc-9E2和Ad/Fc-G19，d-f分别代表接种前24小时，同时，以及接种后24小时用WNV攻击。可以观察到接种Ad/Fc-9E2后产生的抗体量低，说明Ad/Fc-9E2能有效抑制WNV的感染。

米小圈

讨论部分摘要笔记：
对于感染性疾病，抗体依赖的治疗方法受到一些因素的限制，如安全性和经济方面。
治疗性抗体因为ig制备工艺比较精细，需要不断优化促进高产量等因素，所以成药比较昂贵。
基因治疗递送保护性重组抗原进行被动免疫存在很多优势：
体内合成蛋白，能够正确加工。
无需纯化，载体制备工艺已经标化，得以在临床上应用。
重组抗体维持时间较长，和纯化的抗体不同需要多次注射。
复制缺陷型载体系统安全性好。