Identification of a Critical and Conformational Neutralizing Epitope in Human...

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Identification of a Critical and Conformational Neutralizing Epitope in Human Adenovirus Type 4 Hexon

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摘要：
      4型人腺病毒（HAdV-4）感染儿童和成人后，可导致严重的急性呼吸道疾病（ARD）。目前没有获得许可的药物或疫苗。 HAdV-4中和表位的鉴定能够帮助开发新的抗病毒疫苗和新的基因转移载体，有效的单克隆中和抗体（MAb）也可用于开发合适的抗病毒药物。
在本研究中，我们报道了
     ①MAb MN4b对HAdV-4显示出强烈的中和活性。
     ②MN4b识别高变区7（HVR7）内的构象表位（418AGSEK422）。
     ③该位点内的突变允许HAdV-4突变体逃避MN4b的中和并抵抗动物和人抗HAdV-4血清的中和。
     ④重组病毒rAd3-A4R7-1在HAdV-3六邻体的HVR7区域中含有鉴定的中和表位，成功诱导了抑制HAdV-4感染的抗血清。
      这些结果表明HAdV-4六邻体的表面小环是该病毒的关键中和表位。 MN4b的产生和该中和表位的鉴定可用于开发治疗性抗体,亚单位疫苗和可以逃避预先存在HAdV-4中和抗体的新型载体。
重要性
      中和抗体被认为是预防人腺病毒4型（HAdV-4）感染的良好工具，中和抗体识别的表位的鉴定对于重组抗病毒疫苗的产生是重要的。 然而，到目前为止，尚未报道HAdV-4的中和表位。 在这里，我们开发了针对HAdV-4的血清型特异性中和MAb，MN4b。 并证明MN4b识别HAdV-4六邻体的HVR7内的构象表位。 在HAdV-3六邻体上的这种构象表位产生的抗血清抑制HAdV-4对A293细胞的感染。 我们的发现对于治疗性亚单位疫苗和HAdV-4的新型载体的开发非常重要。

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背景介绍：
      人腺病毒（HAdVs）是高度传染性的病原体，在儿童和成人中引起疾病，包括急性呼吸道感染，急性胃肠炎，流行性角膜结膜炎和泌尿生殖系统疾病（1-3）。 迄今为止，已识别出超过81种基因型，分为7种，物种A至G（4-6）。 特定物种的基因型通常与特定的临床表现相关。 HAdV物种C（HAdV-1，HAdV-2，HAdV-5和HAdV-6），B物种（HAdV-3，-7，-14，-21和-55）和物种 E（HAdV-4）最常见于急性呼吸道疾病（ARD）患者。 HAdV-4是最常报道的物种之一，并且在儿科和成人患者中与严重的ARD相关（7-12）。 HAdV-4是未接种疫苗的美国军事学员中ARDs的主要病原体（13-15）。
       基于来自人二倍体细胞的HAdV-4和HAdV-7的活口服疫苗经批准已被用于美国军队新兵中以减少发热性呼吸道疾病（FRI）并显着降低美国军队中FRI的风险（14,16）。 然而，目前没有疫苗被批准用于儿童和成人，并且没有针对腺病毒的有效抗病毒治疗。
      中和单克隆抗体（MAb）是有希望用来预防或治疗病毒性疾病的药物。中和MAb的产生也可用于鉴定中和表位，这是疫苗分子设计中非常重要的步骤。 HAdV-4也被提议作为人类免疫缺陷病毒（HIV）/猿猴免疫缺陷病毒（SIV）的替代载体和流感疫苗中的候选载体（17）。为了逃避体内中和反应，在病毒基因递送载体中修饰中和表位。具有特异性的中和表位可用于构建此类载体（18-20）。腺病毒衣壳由三种主要结构蛋白组成：六邻体，五邻体和纤维蛋白。六邻体蛋白是血清型特异性中和抗体（NAbs）的主要靶标，可以针对任何这些主要衣壳蛋白产生腺病毒中和抗体（21,22）（22-27）。六邻体上的血清型特异性中和表位主要位于塔区，其由七个高变区（HVR）组成，其中HVR7可进一步细分为三个另外的高度可变区（28-32）。 HAdV-4中和表位的特定位置尚未确定。
       在这项研究中，我们报告了一种对HAdV-4具有强烈中和活性的MAb，MN4b，其识别HVR7内的构象表位。 中和试验证实，该位点内的突变体逃脱了来自用HAdV-4免疫的动物的抗血清以及来自感染HAdV-4的人的血清中MN4b的中和。 这些结果表明该表位是HAdV-4六邻体中的关键中和位点。

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本文骨架：材料和方法：
Viral strains and cells.
Defining the potential neutralizing epitope region of HAdV-4 hexon.
Generation of chimeric adenoviruses rAd3-A4R1, rAd3-A4R2, rAd3-A4R5, and rAd3-A4R7-1, which display the HAdV-4 epitopes on HAdV-3 hexon.
Generation of HAdV-4 hexon HVR7 mutants rAd4-A3R7, rAd4-A3R7-1, and rAd4-A3R7-2.
Recombinant peptides and polyclonal antisera.
Generation of NAbs.
Indirect ELISA
Virus neutralization test
Immunoblot analysis

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实验所用主要材料：
重组腺病毒颗粒rAd3EGFP (rAd3)， HAdV-3基因组来自 GZ-01株 (GenBank accession no. DQ099432) ，质粒中删除E3区域，加入报告基因egfp。
野生病毒株HAdV-4 strain GZ01 (GenBank accession no.KF006344.1)
细胞HEp-2和AD293，用于培养腺病毒。
采用氯化铯方法纯化腺病毒颗粒，病毒滴度用1OD=1.1 × 10^12换算。

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三、构建嵌合腺病毒rAd3-A4R1，rAd3-A4R2，rAd3-A4R5和rAd3-A4R7-1
      使用引物对A4HVR1u / HexD，A4HVR1r / HexU和HexU / HexD以pBRAd3dE3GFP作为DNA模板，用重叠PCR延伸诱变产生突变片段H3A4R1。然后将H3A4R1片段克隆到pBRLR中以产生穿梭载体pBRLR-H3A4R1。用相同的策略构建rAd3-A4R2，rAd3-A4R5和rAd3-A4R7-1。  最后，将LR-H3A4R1片段克隆到pBRAd3dE3GFP载体中，使用同源重组技术在大肠杆菌菌株BJ5183中产生HAdV-3六邻体HVR1诱变载体pBRAd3E-A4R1。通过限制性消化和DNA测序分析证实了这些构建体。用AsiSI消化这些质粒以使基因组DNA线性化，然后用Lipofectamine LTX和Plus试剂（Invitrogen，USA）转染AD293细胞。将转染的细胞在37℃，5％CO2下培养6至10天，每天检查细胞病变效应（CPE）。将细胞冻融三次。收集细胞悬浮液，然后用于感染细胞。在感染后96小时，收获病毒并命名为rAd3-A4R1，rAd3-A4R2，rAd3-A4R5和rAd3-A4R7-1。最后，将突变病毒与AD293细胞一起培养在20个培养皿（100mm）中，收获，并用标准CsCl梯度离心纯化。通过DNA测序确认病毒的修饰的六邻体基因。      通过将预测的HAdV-4表位肽整合到HAdV-3六邻体的相应表面环中来构建四个掺入表位的重组腺病毒（图3A）。  ELISA显示MN4b识别rAd3-A4R7-1但不与其他重组病毒反应（图3B）。用连续稀释的MN4b进行的进一步测试证实了这些结果（图3C），这表明MN4b检测到HVR7中的构象依赖性表位。

为了确定这四个位点是否含有中和表位，通过用掺入表位的重组腺病毒rAd3-A4R1，rAd3-A4R2，rAd3-A4R5或rAd3-A4R7-1免疫小鼠产生抗血清。 中和试验显示仅抗-rAd3-A4R7-1血清和阳性对照抗-HAdV-4抑制HAdV-4对AD293细胞的感染（图4）。 因此，仅A4R7-1表位诱导针对HAdV-4的NAb，并且是HAdV-4的重要中和表位。 进一步的中和试验显示，在四种嵌合腺病毒中，只有rAd3-A4R7-1被小鼠抗HAdV-4血清中和（数据未显示）。

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四、构建HAdV-4六邻体HVR7突变体rAd4-A3R7，rAd4-A3R7-1和rAd4-A3R7-2
      构建 携带HAdV-4 GZ01基因组的质粒pBRAd4（GenBank登录号KF006344.1）（45），然后构建携带HVR突变体rAd4-A3R7，rAd4-A3R7-1和rAd4-A3R7-2的质粒。如图9所示，通过重叠PCR延伸诱变产生突变片段H4A3R7（使用pBRAd4作为DNA模板，引物对Ad4-17833u / Ad4-20204r）。然后将H4A3R7片段克隆到MluI消化的pBRAd4载体中以产生诱变载体pBRAd4-A3R7，其在体外与Exnase II（Vazyme，China）进行同源重组。用相同的方法产生质粒pBRAd4-A3R7-1和pBRAd4-A3R7-2。通过限制性消化和DNA测序分析证实成功构建了这些突变体体。然后如上所述在AD293细胞中拯救并纯化突变病毒rAd4-A3R7，rAd4-A3R7-1和rAd4-A3R7-2。

图9  将突变位点引入HAdV-4基因组中的六邻体基因

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五、使用HAdV-4 HVR7突变体确认MN4b识别的表位
      HAdV-4 HVR7可分为两个独立的区域，R7-1和R7-2。为了用独立方法绘制MN4b识别的中和表位，产生了三种重组4型腺病毒，其中将突变引入HVR7的长环中（图5A）。然后通过使用ELISA，Western印迹和中和试验用MN4b筛选这些突变病毒。 R7-2区域中的突变（突变体rAd4-3R2）不影响MN4b对重组病毒的识别和中和（图5）。然而，具有改变的R7-1残基（AGSEK至DANG）的突变体rAd4-3R7-1和rAd4-3R7逃脱了MN4b的中和作用（图5D）。来自ELISA和Western印迹的数据还表明rAd4-3R7-1和rAd4-3R7完全逃脱了MN4b的识别（图5B和C）。 MAb 3D7，一种先前制备的针对HAdV-3的中和抗体（33），用作对照。这些结果证实R7-1残基（AGSEK）形成MN4b识别的关键表位。

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六、R7突变降低了HAdV-4抗血清对中和的病毒易感性
      用中和试验测定R7突变体对抗HAdV-4血清中和的病毒的易感性。 来自小鼠的抗HAdV-4血清显示针对rAd4-3R7-1突变体的中和活性低8倍，针对rAd4-3R7突变体的活性低于针对野生型病毒的16倍。 然而，来自小鼠的的抗HAdV-4血清显示出针对rAd4-3R7-2的活性，其类似于针对野生型HAdV-4的活性。 用兔抗HAdV-4血清观察到类似的结果，中和rAd4-3R7和rAd4-3R7-1突变体的效率低约16至32倍，中和rAd4-3R7的效率低约2倍。中和rAd4-3R7-2的效率比野生型病毒低2倍（图6）。 这些结果表明R7-1含有关键的中和表位，其占小鼠和兔中对HAdV-4的大部分中和抗体反应。

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七、R7突变体对感染HAdV-4人血清中和的敏感性
      所有6种抗HAdV-4阳性血清样品对rAd4-3R7-1和rAd4-3R7的中和活性比野生型HAdV-4低2至4倍，而rAd4-3R7-2显示出相似的易感性。 这些结果证明R7-1是针对人血清中针对HAdV-4的中和抗体的关键靶标。将未显示针对HAdV-4的中和的人血清样品1和2用作阴性对照。