Plasmid DNA initiates replication of yellow fever vaccine in vitro and elicit...

米小圈

Plasmid DNA initiates replication of yellow fever vaccine in vitro and elicits virus-specific immune response in mice

米小圈

摘要：
在热带非洲和拉丁美洲地区，黄热病毒（YF）可导致急性出血热疾病。本研究中利用iDNA感染性克隆技术研发一种新型实验YF疫苗。iDNA质粒编码17D疫苗全长基因组，并在其上游插入CMV启动子。在体内外，iDNA质粒都可以转录病毒全长RNA，并能产生17D病毒。转染10ng iDNA质粒，足以在体外启动病毒复制。
用IFN-α/β/γ受体缺陷型AG129小鼠，对母株17D和iDNA获得的17D病毒的安全性进行了评价。20ugiDNA质粒单次接种BALB/c小鼠，即可在小鼠体内发生血清阳转并且产生特异性中和抗体。
我们认为iDNA免疫方法结合了DNA疫苗接种和减毒疫苗的特点，有希望成为YF的有效免疫手段。

米小圈

背景资料

WHO官方资料显示每年有200,000YF感染病例，其中有30,000死亡病例。

用于生产YF疫苗的毒株有三个，17D-204, 17D-213,和17DD，虽然存在一定的基因型差异，但是3个病毒株的免疫原性和有效性都有保证。单次免疫即可产生长效的保护性免疫，很多接种者不需要加强免疫。

本文中反复强调YF 17D疫苗本身是安全有效的，虽然有副作用，但是很少发生。另外在发生副反应的个例中，接种者的自身个体因素可能起更重要的作用。目前YF疫苗仍使用鸡胚生产，因此对鸡蛋过敏的人就不能接种YF免疫接种的一个禁忌证。因此我们可以采用一种新的免疫手段来代替传统的YF活疫苗接种方式。由于YF cDNA克隆在E.coli中不稳定，妨碍其成为新疫苗。最新的免疫DNA（iDNA）平台，该平台基于分子克隆技术并且结合了DNA疫苗接种和减毒疫苗的特点。本文用iDNA可以在体外成功获得YF 17D疫苗拯救病毒，将iDNA质粒接种BALB/c小鼠诱导机体产生病毒特异性免疫反应，表明使用iDNA技术或许可能作为新的YF疫苗的免疫接种手段。

米小圈

实验所需材料
YF减毒活疫苗株17D(NR-116)，基因序列参见GENBANK:X03700

iDNA是在在RNA-based的YFV感染性克隆pACNR- FLYF\17D的基础上进行构建，构建成两个质粒，pYF17D-5（未加任何多余的序列）和pYF17D-16 （插有内含子序列），质粒转化DH5α或者Stbl3菌。

pYF17D-5和pYF17D-16的区别在于后者在nt9152处插入一个长82nt的内含子序列，选择该位点插入内含子序列是用BPROM软件分析出此处可能在YFV基因组里存在有可能的细菌启动子。改造后的pYF17D-16在细菌中的稳定性和产量明显增高。

米小圈

转染Vero获得拯救病毒

质粒用电转方法，转染VERO细胞。Infectious center assay(ICA), indirect immunofluorescence assay(IFA)和western blot进行鉴定。ICA和噬斑实验类似，区别在于噬斑是用病毒感染，ICA是直接转染质粒后加半固体培养基，4天后染色。Western Blotting试验是在质粒转染或者病毒感染Vero细胞后第8天取样。

ICA试验：Vero细胞转染200ng pYF17D-5和pYF17D-16 iDNA。转染后静置4小时，细胞用含1％琼脂糖覆盖物覆盖， 4天后中性红染色。pYF17D-5和pYF17D-16的感染性分别为1.0x10^3 IC/μg和1.3x10^3 IC/μg。

间接免疫荧光（IFA）: 将Vero细胞转染200ng pYF17D-5和pYF17D-16 iDNA ，转染72小时后，在冷丙酮中固定（注意：材料和方法中IFA描述部分是转染48小时后固定，见P30第一段），使用YF特异性小鼠多克隆血清作为一抗，，FITC标记的山羊抗小鼠作为二抗。PI染细胞核，图中可见YFV抗原在胞浆中表达。

米小圈

Westernblot和噬斑实验

（a）将Vero细胞转染200ng iDNA质粒或者感染10^3 PFU 17D病毒后进行western blot。在转染或感染后第9天收细胞，然后进行非还原的SDS-PAGE电泳。1道，pYF17D-5转染后细胞；2道，pYF17D-16转染后细胞；3道，17D感染的细胞；4道，未处理Vero细胞；5道，SeeBlue Plus2标准蛋白。
（b）转染iDNA或者感染17D病毒后，第8天取上清样品进行噬斑试验。出斑代表两种质粒均能有效启动病毒的复制，另外可以看到拯救病毒噬斑更规整。
（c）iDNA转染或17D病毒感染Vero细胞后的病毒生长曲线。（注意：为了图片更清晰，没有加标准差数据）。在转染后第五天，拯救病毒滴度能达到10^6 PFU/ml 和YF17D病毒一致，YF1D约有一天的生长延迟，可能是因为病毒初始感染的滴度不够高（1000PFU）。
另外做了一个检测iDNA最小量具有感染性的试验，可以看到低至10ng的质粒也可出毒。

米小圈

Replicationof iDNA-derived YF17D in tissues of AG129 mice

IFN-α/β/γ受体缺陷型AG129小鼠，雌性，4-5周龄。两组，每组30只，每只腹腔接种100 μl10^5 PFU的YF17D疫苗株或者iDNA来源的病毒，感染后0-12天，每隔3天，每组处死3只小鼠，取各器官冻存于液氮，用于提取RNA，进行荧光定量RT-PCR实验。在第0,6,15天，每组多处死两只小鼠，取肝，脑，肾，脾，福尔马林固定，石蜡包埋，HE染色。

野生型YFV在小鼠体内的毒性具有IFN-α/β依赖性，病毒皮下免疫IFN-α/β缺陷型小鼠可成为野生型YF感染模型。用10^4到10^6 PFU的YF17D病毒外周途径注射小鼠导致100%死亡。

用AG129模型小鼠分析YF17D病毒和拯救病毒的嗜神经性和嗜内脏性，两组小鼠每只分别皮下接种10^5pfu病毒，每隔三天取小鼠器官，提取RNA，通过定量RT-PCR测定器官内病毒含量。图（a）和（b）是鼠脑和肝中病毒复制曲线。曲线图（c）和（d）是在鼠脑（注意：图解标注有误，此处应该是脾脏才对，结论中有描述，见P32第三段）和肝组织中IFN-γ mRNA含量。

组织切片染色显示两组没有差异

米小圈

Immunizations and serology

质粒调整浓度为400ng/μl，BALB/c小鼠，4 周龄，雌性。每组肌肉注射50μl质粒，对照组小鼠皮下注射10^4PFU的YF17D病毒。免疫后第2-4天取血检测鼠体内病毒血症，第21天测血清内抗体。抗体检测用PRNT,western blot, 和IFA试验。

肌肉注射质粒20μg（注射后进行电刺激）或者104 PFU的 YF17D病毒。免疫后第2-4天取血检测鼠体内病毒血症，未检测到。第21天测血清内抗体，如图的IFA试验（a）拯救病毒组的第1-8只小鼠和（b）疫苗组的第9-15只小鼠，小鼠血清作为IFA的一抗，检测感染VERO细胞的YF-17D病毒，只有一个疫苗组的小鼠（11号），其余的均发生血清阳转。

米小圈

第21天时，PRNT证实免疫小鼠血清阳转
iDNA组免疫的小鼠血清中和抗体滴度要高于疫苗接种的小鼠。

米小圈

YF的发病机理并未研究透彻，目前尚无针对YF的特异抗病毒治疗方式。17D疫苗还在广泛应用，，接种后有极低的几率发生不良反应。目前，一种可能更安全由Vero细胞获得的灭活疫苗，正在处于临床一期研究。另外，还有一些实验室疫苗候选，如NS1蛋白疫苗，表达17DprME蛋白的改造Ankara牛痘疫苗和D4R缺失牛痘疫苗。本研究中，我们使用iDNA技术制备一种新的YFV实验疫苗。YF17D iDNA质粒能够在体外得到拯救病毒，在体内引起免疫反应。在AG129小鼠（YFV感染的生物模型）中，母株17D和拯救病毒都很安全，并且拯救病毒嗜肝性和母株比更弱一些。

    iDNA技术与传统的感染性克隆技术相比，跳过体外转录步骤，可以体内直接免疫，结合了DNA和减毒疫苗的优势。并且，体内直接免疫iDNA可以减少疫苗基因组发生突变的几率。