Construction and application of chimeric virus-like particles of tick-borne e...

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Construction and application of chimeric virus-like particles of tick-borne encephalitis virus and mosquito-borne Japanese encephalitis virus

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摘要：先前我们已经报道了利用反式表达TBEV C/prM/E结构蛋白，包装TBEV亚基因组复制子为只有一次感染性的病毒样颗粒 (VLPs) 。
本文通过反式包装系统，制备TBEV和JEV的嵌合型VLPs。TBEV C/JEV prM/E能够包装TBEV的复制子为嵌合型病毒样颗粒，但是JEV C/prM/E则不能有效包装。说明C蛋白和非结构蛋白之间或者RNA基因组之间的同源性对于包装病毒至关重要。
中和试验表明VLPs的抗原性和野生病毒相似。
另外，鉴定了不同的病毒样颗粒对不同来源的细胞的感染能力，内化作用。将TBEV以及其与JEV的嵌合型VLPs分别感染蜱源细胞ISE6以及蚊虫细胞C6/36。结果说明细胞是影响黄热病毒感染的重要因素，这些嵌合性VLPs的构建为研究病毒基因组的包装和载体特异性相关的特异细胞因素提供了工具，并且因为这些病毒颗粒的安全性，用VLPs代替嵌合性病毒来研究病毒的生物学特性是有可能的。

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研究背景：
黄热病毒属按谱系和生态学划分可分三类：蜱源，蚊源，和未知来源的黄热病毒。节肢动物传播的病毒性疾病其传播的程度主要和媒介载体传播病毒的能力（vector competence）相关。
黄热病毒基因组的5’和3‘-UTR形成的二级结构和病毒的复制，翻译以及包装基因组能力有关联。在病毒包装的过程中，病毒结构蛋白在翻译的同时进入内质网，由NS2B-NS3蛋白酶和信号肽酶进行加工，C蛋白和基因组RNA形成二十面体核衣壳。
对黄热病毒的包装机制仍知之甚少。
复制子在培养细胞系中由于非结构蛋白发挥作用而能进行复制，但是由于缺乏结构蛋白不能包装成病毒。
VLPs和野生病毒在物理特性和感染能力相似。可以替代活病毒进行生物特性研究。
感染性克隆技术的建立便于构建嵌合病毒，是研究病毒复制和开发疫苗的有力手段，也可用于热点研究，如研究不同来源的节肢动物传播的黄热病毒构建的嵌合病毒其病毒载体传播病毒的能力等。

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Cells and viruses. 细胞和病毒

所用细胞：BHK-21细胞，C6/36细胞（蚊虫来源细胞），ISE6 (蜱虫来源细胞).

所用病毒：TBEV病毒Oshima 5-10，JEV病毒 Nakayama

Antibodies. 抗体

所用抗体：兔源多抗抗TBEV-prM, 抗TBEV-E, 抗TBEV-NS3(Yoshii et al., 2004)。 鼠源抗-JE单抗1H4和4H8。（本室制备，用于中和试验），抗-JE E单抗10B4，抗-JE prM单抗13E7，（由Konishi提供，用于WB试验），针对TBEV病毒株Oshima5-10, Langat病毒株TP-21和JEV病毒株Nakayama的鼠源多抗。

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所用质粒：
pcTBECME, 表达TBEV病毒株Oshima 5-10结构蛋白的真核表达载体。
pcJEME，以pcDNA3.1为基础，表达JEV病毒株Nakayama prM和E蛋白的真核表达载体，含一段prM信号肽序列。
pcJECME，以pcDNA3.1为基础，构建的表达JEV Nakayama病毒株结构蛋白的真核表达载体。
pcTBEC-JEME, 表达TBEV病毒株Oshima 5-10 C蛋白和JEV信号肽序列-C/prM蛋白的真核表达载体（以上质。粒在pcDNA3.1的基础上构建）。
pcTBENS2B/3，表达TBEV NS2B–NS3蛋白的真核表达载体（在pCAGGS的基础上构建）。TBEV感染性cDNA克隆质粒 O-IC

TBEV复制子质粒为原来构建的Oshima REPpt (Hayasakaet al.,2004).

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Preparation of VLPs. 制备病毒样颗粒

Oshima REPpt的转录产物RNA电转BHK-21细胞系，孵育24小时后，TransIT-LT1转染真核表达载体。转染后36个小时，收获上清，1000g 离心10分钟，取上清，4℃，用10 % PEG (Mr58000)和1.9 %NaCl 沉降2小时，10 000gf离心20 分钟，用含RNase A (20μg/ml)的PBS重悬沉淀。

g，h，i 二次感染，上清液分别来自a，d，f；a，d能产生一次性病毒颗粒。i是转染的全长IC；IFA检测被感染细胞中的病毒TBEV NS3的表达。

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SDS-PAGE和WB实验

转染后细胞/上清液中的蛋白进行定性。使用的检测抗体为抗-E或者抗-prM抗体。复制子RNA电转BHK-21细胞后24小时，脂质体转染4种不同的真核表达载体，分离上清和细胞裂解物进行WB实验。

C RNA homology requirement for the secretionof VLPs

WB结果显示prM蛋白都是独立存在的，和C蛋白是分离的，没有检测到C-prM联合蛋白，根据以往报道，C-prM连接处能够在胞浆内侧被NS3蛋白识别切割，进而在内质网腔内被内质网信号肽酶识别切割，形成独立的prM蛋白。

pCJEME上清中检测到的E条带可能是亚病毒颗粒（没有核衣壳）。

收集的上清液进一步感染BHK-21细胞，IFA检测VLPs滴度。

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收集的上清液进一步感染BHK-21细胞，IFA检测VLPs滴度。
不同稀释的VLP颗粒感染固定在载玻片的BHK-21细胞，37℃孵育24小时，4%多聚甲醛进行固定， 0.2% Triton X-100打孔，TBEV-NS3兔多抗进行检测，二抗用FITC-抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch).(此处有误，二抗应该选用FITC标记的抗兔的抗体，P202页），共聚焦显微镜下分析结果。

中和抗体实验中，用100IU的病毒样颗粒和不同稀释度的抗体结合，孵育1.5小时后感染细胞，同上利用免疫荧光实验计算病毒滴度。

用moi=1的量感染ISE6或者C6/36细胞，孵育48小时，同上利用免疫荧光实验计算病毒滴度。

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和pcTBECME以及pcTBEC-JEMEA共转染复制子载体Oshima REPpt RNA后，能产生滴度高达10^6 IU/ml 病毒颗粒。
和pcJECME共转染复制子载体Oshima REPpt RNA后，能产生250 IU /ml的病毒颗粒。
将分泌的VLPs进行稀释，半定量RT-PCR检测TBEV复制子RNA。
这些结果显示pcTBECME以及pcTBEC-JEME和TBEV复制子载体共转染细胞后能产生较高滴度的VLPs，说明C蛋白和非结构蛋白之间的同源性对于病毒的有效包装很重要，pcJECME组不能产生病毒颗粒，提示C蛋白和E蛋白之间同源并不能进行病毒的包装。

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Secretion of subviral particles fromcells that express chimeric structural proteins and NS2B–NS3 proteins

为了区分病毒样颗粒和亚病毒颗粒，对pcTBECME以及pcTBEC-JEME和TBEV复制子载体转染细胞后产生的VLPs进行鉴定。