Differential effect of the Deletion of African Swine fever virus virulence...

傲慢与偏见

Differential effect of  the Deletion of African Swine fever virus virulence-Associated Genes in the Induction of Attenuation of the Highly Virulent Georgia Strain

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摘要：
ASFV(ASFV)是猪瘟的致病原，可以导致死亡。
毒株ASFV Georgia 2007 (ASFV-G)是目前在欧洲和亚洲引起猪瘟的流行株。
毒力相关基因缺失的基因重组病毒毒性可以降低，并且能在猪体产生保护性免疫作用。
NL (DP71L)和UK(DP96R)基因是两个ASFV毒力相关基因，E70病毒株去除了这两个基因中任意一个都能引起病毒毒力下降。
鉴于ASFV Georgia 2007和E70毒株序列的保守性，将ASFV Georgia 2007毒株的UK基因和NL基因也进行删除，构建基因缺陷的重组病毒。

ASFV-G-ΔUK病毒和母株比较毒力未发生改变，ASFV-G-ΔNL毒力显示出不同的异质性，五只实验猪中一只很快死亡，另四只出现短暂的发热症状。

此外，构建了三基因缺失的重组病毒ASFV-GΔ9GL/ΔNL/ΔUK，该病毒能在原代猪巨噬细胞中生长，但是在实验猪体内却有严重的复制缺陷，针对毒株ASFV-G的攻击也不具有任何保护作用。

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背景资料：

非洲猪瘟（ASF）是猪的一种传染性病毒性疾病。ASFV是一种大包膜病毒，基因组是一190kb的双链DNA。ASFV与其他大型dsDNA病毒（例如痘病毒科，虹膜病毒科和藻类病毒科）相比，具有相同的基因组结构和复制模式。根据宿主特征和病毒株的毒力的不同，ASF引起的一系列疾病，从高致死到亚临床症状差别很大。ASFV感染家猪通常致命，有高烧，出血，共济失调和严重抑郁等症状。研究表明，当同源亲本病毒攻击时，用含有特定病毒相关基因缺失的减毒活疫苗免疫猪可以起到保护作用。

ASFVs病毒基因组中缺失UK（DP69R）基因、23-NL（DP71L）基因、TK（A240L）基因、9GL（B119L）基因、 MGF360-530的6-9基因和DP148R基因，可以使毒株毒性降低。使用这种毒性减弱的重组病毒免疫动物，在受到其同源亲本病毒的感染时能够免受疾病的攻击。目前开发的减毒活疫苗主要基于这些设计思路而进行研制的。

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目前开发针对不同分离株的减毒活疫苗，其理论基础主要来源于基因缺失导致病毒活性降低。然而，目前大多数已经报道的基因缺失，仅在少量的病毒分离株中进行验证。比如：三个ASFV毒株（Malawi，Pretoria和Georgia 2010）中删除高度保守的9GL基因，导致了不同程度的毒力衰减。E70毒株删除NL基因后毒性完全降低，但是Malawi毒株删除NL基因后毒力未有改变，等等。

识别和鉴定猪瘟病毒毒力相关基因，对于ASFV疫苗的开发是至关重要。NL (DP71L)或者UK (DP96R)基因在已有报道中认为是毒力相关基因。

ASFV Georgia2007/1，基因II型，是强毒株。

由于毒株E70和Georgia之间的氨基酸序列高度保守，因此本研究中，我们在ASFVGeorgia 2010 (ASFV-G)基础上，构建了NL (DP71L)或者UK(DP96R)基因的缺失毒株。结果显示，与母株相比， UK缺失（ASFV-G-ΔUK）的毒株毒力并没有降低，NL基因缺失的毒株部分减毒。由此可见，NL和UK这两种基因在不同毒株中的毒力差异效应可能取决于病毒基因组中的其他因素。

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实验用材料：
从去纤维蛋白的猪血液中制备原代猪巨噬细胞，用于培养病毒，按moi=0.1感染细胞，绘制病毒的生长曲线ASFV Georgia (ASFV-G)病毒株
通过血吸附实验评价病毒的存在，用Reed and Muench法检测病毒滴度。

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重组病毒的构建
ASFV基因组和穿梭质粒（由p72mCherry构建）进行同源重组，构建NL和UK基因缺失的重组病毒，其中NL基因缺失160个核苷酸（53个氨基酸），UK缺少256个核苷酸。之前有报道，西班牙来源的E70病毒株NL/UK缺失后病毒毒力都有所下降，E70和Georgia 2010毒株的NL (DP71L)和UK (DP69R) 基因之间高度保守， 氨基酸比对两个病毒株之间NL (DP71L) 和UK (DP69R) 基因的同源性分别为94%和96%。因此，本研究中预测Georgia 2010毒株删除 NL (DP71L)和UK (DP69R)基因后毒力会下降。

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病毒感染巨噬细胞后，转染穿梭质粒，通过同源重组获得各基因缺失的重组病毒。
穿梭质粒载体为p72mCherry，启动子为ASFV p72W晚期基因启动子，如图所示虚线部分内是删除掉的基因片段。
除了两个NL/UK基因单独被删除外，另外，制备了9GL-NL-UK三基因缺失的重组病毒 ASFV-G D9GL/DNL/DUK。

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二代测序鉴定ASFV基因组的序列
重组病毒经过几次有限稀释法进行纯化，最后一轮纯化后在原代猪巨噬细胞中进行放大培养。病毒基因组用Illumina NextSeq测序仪进行二代测序。ASFV-G-Δ9NL和ASFV-G-ΔUK重组病毒除了有穿梭质粒p72mCherry中的3295个核苷酸序列外，其它无突变。

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重组病毒在原代猪巨噬细胞中的培养
重组病毒以moi=0.1感染原代猪巨噬细胞，感染后2，24，48，72，96小时时收样，结果显示（图3），ASFV-G-ΔUK显示出与母株ASFV-G病毒相似的生长动力学。ASFV-G-ΔNL复制能力略微下降，同时间点病毒滴度比ASFV-G或重组ASFV-G-ΔUK低约10倍，除了96 h时，ASFV-G-ΔNL的滴度较低，三种病毒的生长曲线之间没有统计学差异。之前报道显示，ASFV E70病毒株缺失NL 或UK基因的重组病毒，在原代猪巨噬细胞培养物中复制能力不受影响。

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NL (DP71L)或UK (DP69R)基因缺失对猪ASFV-G毒力的影响

之前报道称，从西班牙分离株E70的基因组中单独删除NL（DP71L）或UK（DP69R）基因后的重组病毒株，在实验条件下感染猪后，病毒毒力急剧下降，用剂量高达10^4 HAD50重组缺失病毒株肌肉注射猪，只会引起短暂的体温升高。

因此，我们评估相似的基因缺失是否同样会改变高毒性ASFV-G分离株的毒力。

使用80-90磅的商业品种雌性猪评估ASFV-G-重组病毒以及亲本ASFV-G病毒的毒力。每组5只，肌肉（IM）接种10^4HAD50重组病毒或ASFV-G。

肌肉注射10^4 HAD50 ASFV-G的猪，4-5天内表现出体温升高（>104°F），进一步出现严重临床症状，包括厌食，抑郁，紫色皮肤变色，步态蹒跚和腹泻。随着时间的推移，疾病的迹象迅速恶化，动物死亡或在5-6天濒临死亡时被安乐死。

注射10^4HAD50 ASFV-G-ΔUK的猪，表现出与母株ASFV-G感染动物后出现的临床症状相一致。攻毒3-4天后，猪开始出现短时间的发烧，第5天时，动物死亡或因濒临死亡而安乐死。而肌肉注射10^4HAD50 ASFV-G-Δ9NL的5只猪表现不一致。一只猪在第5天时突然死亡，尸检显示与超急性疾病相似的临床病变。剩余的四只动物，在攻毒后第4天，出现短时间的发热，此后在整个观察期内出现周期性的体温短暂升高，其余21天在临床上保持正常。