Subgenomic Replicons of the Flavivirus Kunjin: Construction and Applications

傲慢与偏见

Subgenomic Replicons of the Flavivirus Kunjin: Construction and Applications

傲慢与偏见

摘要:
本研究构建了KUN病毒几个去除结构蛋白基因(C-prM-E)以及非编码区(3＊UTR)的亚基因组复制子:
① RNA△ME(C417-E2403)去除1987nt，
② RNAC20rep(C157-E2403)去除2247nt。
电转后能有效在BHK21中复制。
RNAC2rep进一步切除RNAC20rep C端序列53个核苷酸后，RNA则不能复制。
③ RNA△ME/76是在RNA△ME(C417--E2403)基础上去除3＊UTR(10423-10498)上76个核苷酸，RNA能有效复制。
④ RNA△ME/352是在RNA△ME(C417--E2403)基础上去除3＊UTR(10423-10774)上352个核苷酸，包括两个保守序列RCS3和CS3，复制能力受到抑制。
在RNA△ME/76的3＊UTR中插入报告基因CAT，分正反向插入两种，受IRES调控，电转后正向插入的RNA能够自主复制，复制能力和RNA△ME/76相较低10-20倍，但是能够表达CAT蛋白；反向插入的RNA虽然能够自主复制，并且复制能力和RNA△ME/76相似，但是不能够表达CAT蛋白，说明KUN负链RNA合成后不能从模板上释放出来。
⑤ 以Neo基因代替RNAAME/76CAT中CAT基因，制备的复制子经过在BHK21细胞中的筛选，在第41天(传9代）稳定复制，并且没有细胞病变发生。
本研究的意义在于通过构建的复制子载体了解黄病毒基因组的复制特性，构建无细胞毒性和能持久表达的RNA载体。

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背景资料：
Kunjin病毒属于黄热病毒属，在澳洲爆发流行。
基因组长11022个核苷酸，一个读码框，编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白。
本实验室已经构建了KUN的全长RNA-based感染性克隆。
在此基础上构建一些有自主复制能力的删除结构基因的复制子载体，用于进行黄热病毒RNA复制能力的研究。
使用复制子一个最大的优势是：将病毒基因组复制和病毒包装和成熟的步骤分割开，从而对和病毒复制能力有关的蛋白，基序，RNA序列进行准确的功能界定和基因定位。

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有很多正链RNA病毒已经构建为亚基因组复制子，如Sinbis病毒，SFV病毒，脊髓灰质炎病毒，人鼻病毒14。mRNA复制子可以用来表达异质基因，RNA病毒复制子的宿主范围广，胞浆表达量高。
如甲状病毒属的Sinbis病毒载体，SFV载体能高效表达异质蛋白，辅以表达结构蛋白的辅助质粒，能包装出完整的病毒颗粒。
但是这些载体也存在一些缺陷，比如对细胞有严重的细胞毒性。因此限制了这些载体长效表达异质基因表达的使用，以及在疫苗研制中的应用。
本研究中，通过删除结构蛋白基因和3-UTR部分区域，构建了一系列的KUN复制子载体。
同时在3-UTR区插入了CAT或者NEO基因，构建KUNjin复制子载体的双顺反子。
转染细胞后经过G418筛选，建立能稳定表达复制子载体的细胞系，41天依旧没有细胞病变。
证明了KUNJIN复制子载体作为一个长效表达，无细胞病变的RNA病毒表达载体的可行性。

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主要实验材料：
BHK-21细胞anti-NS3抗体：杆状病毒系统表达的NS3蛋白，皮下接种成年兔，获得的anti-NS3多抗。
本研究中构建的Kunjin质粒载体
A： kunjin基因组  
B：RNA△ME(C417-E2403)去除1987nt，包括C蛋白的C端107个氨基酸序列，E蛋白保留了22个氨基酸。
C蛋白被认为对正链RNA的合成起调控作用，另外参与黄热病毒基因组复制时C基因的RNA环化。
C：RNA △CME去除了94-2379位的核苷酸，起始密码子利用E2379上的ATG，E蛋白保留有30个氨基酸，包括NS1信号肽序列，能保证NS1蛋白和其他非结构蛋白的正确加工和定位。

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首先用NS3抗体间接免疫荧光检测RNA△ME和RNA△CME电转BHK-21细胞后的复制情况。
转染后2-8小时后，两者IFA均为阴性。
RNA△ME转染12小时后呈现弱阳性，24-48小时后10-20%的细胞呈阳性结果，直到第15天仍然有阳性结果，值得注意的是整个培养过程中没有细胞病变。

RNA△CME始终为阴性结果，没有检测到阳性信号。

用RT-PCR进一步进行鉴定：
RT-PCR结果RNA△CME始终为阴性结果，6小时的时候包括阳性对照AKUN RNA结果都为阴性，而转染24，48，72小时，阳性对照和RNA△ME的结果为阳性。


Northern Blot结果和RT-PCR结果一致，显示△ME RNA在转染后24-72小时能复制聚集。

以上实验证实

构建的复制子载体RNA△ME有复制能力，而RNA△CME没有复制能力。

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根据RNA △ME和RNA △CME的实验结果，进一步研究RNA △ME中影响复制能力的C蛋白中最短序列，构建两个新的复制子载体。
D: △ME/76 cDNA (C107rep)，3-UTR区去除了76个核苷酸，和B ：△ME RNA的复制能力相似。
E：C20rep，在D的基础上进一步去除C蛋白，保留了C蛋白前20个氨基酸，其中包括NMLKR黄热病毒的保守序列（除了YFV），此外黄病毒属有8位保守的核苷酸序列。(Fig. 1E中下划线标注的 TCAATATG 137-144位) ，和3-UTR区（10918-10925位）互补，参与RNA的环化。KUNjin病毒的该保守序列为12位，1E方框里显示的序列。
F：在D的基础上进一步去除C蛋白，保留了C蛋白前2个氨基酸。和C：△CME RNA很相似。

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首先验证C基因的缺失对蛋白翻译本身有无影响。
对几种RNA复制子进行体外翻译（利用兔网织红细胞裂解物），可以看到几种RNA产物的翻译效率相似，不受C基因长短的影响。

进一步检测C基因的缺失对基因组复制是否有影响。
用抗-NS3的抗体进行IFA检测，电转后24-48小时，可以看到转染 ▲ME/76(C107rep) 或者C20rep的细胞有10-20%的阳性信号（图B1，B2)，而转染 C2rep的细胞在48小时后也检测不到阳性信号(图B3），和之前的▲CME RNA结果比较一致。
图B4为未转RNA的BHK-21细胞空白对照。

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进一步用Northern杂交分析各种复制子在转染细胞后的复制情况：
这组实验用的探针是针对3-UTR区。
(A) 电转后6小时，包括感染性克隆pAKUN在内的各载体检测不到RNA，和原来的结果一致，病毒基因组复制会有延迟，转染用的RNA不足以检测出来。
电转后24小时，AKUN, DME/76 (C107rep), C20rep RNAs能检测到RNA的复制。
而C2rep RNA直到48小时也检测不到RNA 以上结果说明C基因的前60个核苷酸对于RNA的复制至关重要。
(B) 细胞内RNA标记
将细胞放在含有放射性核酸底物的培养基中进行培养，然后从这种细胞中分离DNA或RNA，由于细胞在生长过程中掺入了放射性的底物32Pi，因而被带上了标记。
如图可见到全基因组在11kb处有阳性条带，复制子在9kb处有阳性条带。

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为了进一步研究3-UTR区对基因组复制的影响，以及探索是否能在该区域插入外源基因。

在▲ME复制子的基础上构建了两个复制子载体，1H和II

两个复制子载体都是从10423位（终止密码子后第26位）开始删除，加了一个Mlu I酶切位点，分别删除76个和352个核苷酸（包括保守序列CS3和RCS3）

依旧用IFA和northern杂交检测复制子表达情况。

结果▲ME/76复制能力和▲ME很相似，而▲ME/352复制能力明显受到抑制。

5a图显示了Northern杂交的结果，以抗NS3抗体进行检测的IFA结果和northern杂交结果一致。