鼠源抗人乳腺癌MRP1/ABCC1噬菌体Fab抗体库的构建

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鼠源抗人乳腺癌MRP1/ABCC1噬菌体Fab抗体库的构建

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摘 要：
目的：构建鼠源抗人乳腺癌多药耐药相关蛋白l (muhidrug resistance—associated protein l，MRP1／ABCC1）噬菌体Fab抗体库
方法：首先是利用乳腺癌组织匀浆液作为免疫原免疫BALB/c小鼠，成功免疫后提取小鼠脾组织的总RNA逆转录为cDNA。然后设计小鼠IgG各亚型的特异性 引物．PCR扩增 Fd和L基因并依次连接到噬菌体栽体pComb3中。重组体pComb3一Fab转化至E.coli XL1一Blue菌中，最后经辅助噬菌体VCSM13超感染，成功构建噬菌体Fab抗体库。
以化学合成的MRP1／ABCC1膜表位10肽为抗原进行3轮淘选、富集，对淘选后获得的各级噬菌体抗体库进行ELISA检测和鉴定。
结果：成功获得的抗MRP1／ABCC1—1O肽三级噬茵体Fab抗体库。
结论：将为抗人乳腺癌MRP1／ABCCl Fab抗体的制备提供保障。
关键词：Fab抗体；多药耐药相关蛋白1 （MRPI／ABCC1）；乳腺癌

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乳腺癌是世界范围内危害女性健康的恶性肿瘤之一。国内妇女乳腺癌的发病率比世界其他国家低，但最近的调查显示，其正呈逐年上升的趋势。
化学疗法作为治疗肿瘤的经典方法之一，临床上被广泛应用于乳腺癌的治疗。
然而，多药耐药的发生往往导致临床上绝大多数乳腺癌患者化疗失败。MRP1／ABCC1是一种被认为和乳腺癌患者多药耐药发生密切相关的跨膜转运蛋
白。
相对于正常的乳腺组织，MRP1／ABCC1在乳腺癌肿瘤组织中的含量明显增高。
乳腺癌患者接受化疗后肿瘤组织MRP1／ABCC1的含量明显高于化疗前肿瘤组织MRP1／ABCC1的含量。
MRP1／ABCC1在复发转移的乳腺癌组织中高表达，且与淋巴结转移明显相关。
可见，加强对MRP1／ABCC1的检测，对乳腺癌多药耐药的监测至关重要。
目前用于检测MRP1／ABCC 1的特异性抗体几乎均为完整的单克隆抗体。完整的单克隆抗体相对分子质量大、组织穿透力弱，在MRP1／ABCC1的检测中具有局限性。
本研究通过构建鼠源抗人乳腺癌MRP1／ABCC1噬菌体展示Fab抗体库，为进一步制备抗MRP1／ABCC 1的小分子抗体(Fab抗体）提供实验基础。

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主要实验材料
TRIzol Reagent
MRPI／ABCC1—10肽(DPIVNGTQEH）
ALP标记马抗小鼠IgG抗体
抗噬菌体蛋白Ⅲ抗体Balb/C小鼠
E．coli XL1-Blue菌种、E．coli Top10菌种
噬菌粒载体pComb3
T载体
辅助噬菌体VCSM13

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动物免疫
将15例耐药大肠癌病理组织等量混合，加入适量灭菌生理盐水，用细胞匀浆仪制备成匀浆液(50g/L)。
匀浆液与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化后，用0.22 um微孔滤器过滤除菌即得到抗原液。
抗原液经腹腔注射(0.5 mL／10g）8只BALB／c小鼠。
分别在初次免疫后14 h和30 h同样方法再次免疫BALB／C小鼠。
7 h后取小鼠血清。ELISA法测定抗体滴度。处死抗体滴度大于1：512的小鼠，留取脾脏组织。
Q1：为什么用大肠癌病理组织匀浆液进行免疫？
Q2：首次免疫用弗氏完全佐剂，是细胞免疫和体液免疫强刺激剂，佐剂活性最强，首次免疫会选择弗氏完全佐剂，为了减少副作用，增强免疫会选择用弗氏不完全佐剂。

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引物的设计与合成
从IMGT网站检索小鼠IgG各亚型(IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3)重链基因序列及轻链基因序列(K链和λ链)。比对分析重链FR1区及铰链区基因序列，设计引物：
Fd引物：5条上游引物：Xho I CTCGAG
HB1：GCGCTCGAGCAGKTCCAGCTGAAGCAGTC；
HB2：GCGCTCGAGCAGGTTCARCTGCARCAGTC
HB3：GCGCTCGAGCAGGTGCAGCTGAAGSAGTC
HB4：GCGCTCGAGGAAGTGMWGCTGGTGGAGTC
HB5：GCGCTCGAGGAAGTGAARMTTGAGGAGTC
Fd引物：1条下游引物：Spe I：ACTAGT
HF1：GCGACTAGTGCATTTGCATGGAGGACAG
同时分析轻链FR1区及恒定区基因序列，设计轻链L引物
L引物：5条上游引物：Sac I：GAGCTC
LB1：GCGGAGCTCGATRTTGTGATGACCCARAC
LB2：GCGGAGCTCCGATGTTGTKSTGACYCAAAC
LB3：GCGGAGCTCGAAAWTGTKCTCACCCAGTC
LB4：GCGGAGCTCGATATCCAGATGACACAGAC
LB5：GCGGAGCTCCAGGCTGTTGTGACTCAGGAATC
L引物：2条下游引物：Xba I：TCTAGA
LF1：GCGTCTAGACTCATTCCTGTTGAAGCTCT
LF2：GCGTCTAGAGGACAAACTCTTCTCCACAG
其中Y=C，T; W=A，T; M=A，C；R=A，G；K=G，T；S=G，C。

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组织总RNA 的提取和cDNA 的获得，PCR 扩增重链Fd段基因及轻链基因
两者都是660bp左右

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轻链基因与pComb3载体重组
轻链L基因经Xba I和Sac I双酶切，酶切产物进行凝胶回收并定量。 T载体和回收后的轻 基因，经T4 DNA连接酶连接，将连接产物热激转化至E．coli Top10感受态细胞，并涂布LB／Amp／X—Gal／IPTG平板，37℃过夜培养。统计蓝、白斑数，并计算重组率。
重组率=白色菌落数／(蓝色菌落数+白色菌落数)x100％
反复几次上述步骤，最终使白斑数达到1xl0^5 以上，即得T-L库。
Q3: T载体是一种高效克隆 PCR 产物（TA克隆）的专用线性化载体。无需酶切可直接与具有A末端的PCR产物连接，属于非定向克隆。轻链L基因经过酶切后和T载体无法进行连接构建T-L库。

提取库质粒。分别将pComb3载体和T-L库质粒经Xba I和Sac I双酶切，酶切产物进行凝胶回收并定量。回收后的pComb3载体和回收后的轻链基因，经T4 DNA连接酶连接，将连接产物热激转化至E．coli Top10感受态细胞，并涂布LB／Amp／Tet平板，37 ℃过夜培养，计算总菌落数。用LB液体培养基刮取平板上菌落，加入终浓度至10％的甘油，一80℃保存。
反复几次上述步骤，最终使pComb3-L克隆数达到1xl0^5 以上，即得pComb3-L库，提取pComb3一L库质粒。
Q4：pComb3载体携带Amp抗性基因，Top10菌无任何抗性，因此用LB／Amp／Tet的平板涂菌，如果载体和菌本身没有Tet抗性基因，理论上讲细菌是不应该生长的。

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重链基因与pComb3-L载体重组
分别将pComb3一L库质粒和重链尉基因经Xho I和Spe I双酶切，酶切产物进行凝胶回收并定量。
回收后的pComb3-L质粒和回收后的重链基因，经DNA连接酶连接，将连接产物热激转化至E．coli XL1-blue感受态细胞，并涂布LB／Amp／Tet平板，37 ℃过夜培养，计算总菌落数。
用LB液体培养基刮取平板上菌落，加入终浓度至10％的甘油，一80℃ 保存。反复几次上述步骤，最终使pComb3-L-Fd克隆数达到1xl0^5 以上，即得Fab抗体库，最终得到1.49xl0^5 库容量的Fab库。
随机挑取10个单克隆，并提取质粒。各质粒分别经Xho I/spe I、Xba I／Sac I双酶切，酶切产物进行凝胶电泳，计算Fab抗体库Fab基因插入率。两片段均为650bp左右，Fab抗体库基因插入率为81%，有效库容为1.21xl0^5
Q5：结合Takara DL10000 Marker，这张电泳图的槽点还是挺多的，首先，酶切不完全，每个条带中最亮的带理论上应该是单切的线性质粒，进行酶切反应时，减少质粒用量或者提高酶的用量都可以获得酶切完全的图片。另，左边轻链的大小和Fd片段大小明显有差别，差不多有50bp左右。再，如果左右克隆的编号一一对应，那么4号，7号，8号大小和理论值是不一致的，其中4号轻链可能存在问题。7号是一个未插入Fd基因的pCOMB3-L质粒，8号载体有多余序列。

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鼠源抗人乳腺癌Fab抗体库经辅助噬菌体VCSM13感染后，获得噬菌体抗体库。
以MRP1/ABCC1-10肽为抗原，进行三轮“吸附-洗脱-扩增”。