Effect of mucosal and systemic immunization with virus-like particles of seve...

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Effect of mucosal and systemic immunization with virus-like particles of severe acute respiratory syndrome coronavirus in mice

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摘要笔记：
滴鼻免疫是粘膜疫苗接种的一种有效途径，操作简单，应激反应小。
通过杆状病毒/昆虫细胞表达系统（B/IC）可获得SARS的病毒样颗粒，皮下注射VLP的免疫小鼠能诱导产生特异的体液和细胞免疫。
本研究是用滴鼻免疫的方式将sars vlp接种小鼠，观察粘膜免疫反应。
两种途径均能诱导血清特异性IgG升高，滴鼻组血清滴度相对较低，但是局部粘膜SigA的升高更明显。
ELISPOT检测出腹腔组产生细胞免疫。
由此可见，rBV SARS-CoV VLPs 能产生有效的保护性系统和粘膜免疫反应，有研发为新疫苗的应用前景。

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背景资料笔记：
SARS-CoV 为正义单链RNA 病毒，含11 个开放阅读框，有5个为已知蛋白，为S 蛋白( spike protein)，3a蛋白，E 蛋白(envelope protein)，M蛋白(membrane protein) 和N 蛋白(nucleocapsid protein)。
S 蛋白上存在中和抗体表位，可能是病毒诱发机体免疫生成抗体及T 细胞免疫反应的主要抗原蛋白。
S蛋白上氨基酸的改变会引起病毒毒力的改变，说明S蛋白和病毒毒力相关。
M蛋白是一个广泛存在的结构蛋白，在冠状病毒组装过程中发挥重要作用。
病毒样颗粒是一种具有很多优势的疫苗类型，比减毒活疫苗和灭活疫苗要安全，抗原性优于亚单位疫苗和多肽疫苗，能诱导产生更强的免疫反应。
HIV，轮状病毒，HCV，HPV都有成功获得的VLPs。其中如HPV VLP已经进入临床实验。
SARS的病毒样颗粒可以通过杆状病毒/昆虫细胞得以表达，能活化未成熟的树突状细胞高表达共刺激分子和细胞因子。
除了系统免疫应答外，粘膜免疫也起到重要作用。
本文主要研究了SARS VLPS刺激机体后产生的系统免疫和粘膜免疫。

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实验用材料：
佐剂CpG寡聚核苷酸：TCGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTT
非CpG寡聚核苷酸：TGCTGCTTTTGTGCTTTTGTGCTT
由杆状病毒系统制备的含有SARS病毒S,E,M蛋白的病毒样颗粒。

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免疫接种流程
BALB/c小鼠，雌性，6-8周龄，SPF级。
十组，每组六只，随机分配。
鼻饲或者腹腔注射20ug（溶于20ul的PBS）的SARS病毒样颗粒。
免疫时，每次接种10ul，间隔30min，再免疫10ul，一共20ul。
加或者不加佐剂。

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末次免疫后两周取血清，唾液，阴道冲洗液，粪便，肠，肺。ELISA检测血清中SARS-CoV特异性IgG。
如图，腹腔接种免疫组血清抗体滴度高于鼻饲组。
佐剂没有起到增强免疫应答的作用。

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病毒感染时，粘膜表面产生分泌型IgA，ELISA检测不同分泌物中的IgA。
结果如图

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粘膜组织（肺，肠）中SIgA的检测如图：

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中和活性检测
制备HIV基础上的S假病毒颗粒，用各12ug的pHIV-Luc (pNL4.3.Luc.R-E--Luc)和S蛋白表达载体共转染2×10^6的293-T细胞，转染后8小时更换培养基，48小时后收毒，3000g离心去碎片，0.45um过滤， 冻存假病毒颗粒。中和实验利用假病毒颗粒中的报告基因LUC表达系统进行检测。

由图可见，血清中中和抗体滴度高于阴道分泌物，鼻饲组高于腹腔注射组，加佐剂组高于单独注射VLPs组。

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ELISPOT检测：
检测腹腔注射组小鼠细胞免疫反应。检测各组小鼠血清中Th1类细胞因子(常用IFN-r、也可以测IL-2)和Th2类(常用IL-4、也可以测IL-10)细胞因子水平。
可见小鼠血清中IFN-r水平较高。细胞免疫主要以分化为TH1类细胞为主。
鼻滴组数据未给出。