纳米抗体技术及其在疾病诊断和治疗中的应用

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纳米抗体技术及其在疾病诊断和治疗中的应用

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自1993 年首次报道在骆驼体内天然存在的重链抗体(HCAb)以来，由于其可变区间VHH(纳米抗体)具有体积小、溶解度高、特异性强以及可在细菌中大量表达等优点，较之传统单克隆抗体，VHH 在疾病的诊断治疗及药物开发等医学领域具有更广阔的应用前景。
本文综述了：
① 纳米抗体的骨架区及互补决定区与传统抗体重链相应区间的结构比较；
② 纳米抗体库的构建以及运用噬菌体展示技术对VHH库的筛选；
③ 纳米抗体技术在疾病诊断中的应用及其用于分子显像的优势；
④ 纳米抗体作为抗肿瘤免疫偶联物的靶向组分在癌症治疗领域中的最新进展。

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20 世纪90 年代，Hamers-Casterman 等在骆驼科动物的血清中发现了一种缺乏轻链的特殊抗体，称之为重链抗体(HCAb)，该结构后来在鲨鱼、蝠鲼和鳐鱼等软骨鱼类的体内也有发现．HCAb 不仅完整保留了抗原结合区域结构，而且保持了与抗原结合的高亲和力．同软骨鱼类相比，骆驼抗体恒定区与人类的较为相似，容易进行动物免疫实验，因此，目前纳米抗体技术研究主要集中在骆驼科单链抗体及其派生物。

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纳米抗体结构
传统的IgG 由2 条重链和2 条轻链构成，2 条重链之间以及重链和轻链之间通过二硫键进行连接(图1)。VH区和VL区之间通过二硫键相互连接形成抗体的可变区(Fv)，是抗体识别抗原的最小单位。
骆驼中发现的单链抗体(HCAb)缺少轻链和重链CH1，只含有重链CH2、CH3 和可变区。单域抗体通过重链上的一个可变区（VHH）结合抗原，该可变区可以单独稳定地在体外存在，被称为驼类单域抗体(SdAb)或者纳米抗体（nanobody）。
纳米抗体晶体宽为2.5nm，长4nm，分子量仅为传统完整抗体的1/10（约15kD）但依然具有完整的抗原识别能力，
骆驼VHH 骨架区序列与人VH 相比同源性超过80%。

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VH和VHH 的结构差异和传统IgG相比，骆驼的纳米抗体除了缺少轻链之外，其重链可变区和铰链区之间没有CH1。
1. 骨架区保守序列差异
① 传统IgG重链可变区结构中在VH 和VL 的交界处，有3 个位点，Gly44、Leu45和Trp47，参与和VL的相互作用， 骆驼源化的VHH 该区域(Gly44Glu-Leu45Arg(或Leu45Cys)-Trp47Gly)，由疏水氨基酸突变为亲水氨基酸，使纳米抗体更易于溶解。
实验证明：溶液中VH 蛋白质浓度超过1 g/L 时会发生聚集沉淀．而骆驼源VHH 蛋白质聚集程度显著降低，说明这些位点处于蛋白质表面，改为亲水性残基可增加VH 溶解度.
② 在单峰驼VHH-FR2 区域中Leu11 被替代成Ser11。
2. 互补决定区结构差别
VHH 与VH 在高变区(hypervariable，HV)的显著差异主要体现在残基数量及区域结构的不同。
VHH-HV1 的残基数扩大到27～35，增加的残基27～30构成新的β转角，对VHH的溶解度提升，和抗原的结合有一定的帮助。
VHH 与VH最显著、最重要的差异在于HV3。人和鼠VH区的CDR3平均长度分别为12个和个氨基酸，而纳米抗体长度为12～18 个氨基酸，频率最高，明显长于人和鼠中VH-HV3 的平均长度。

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VHH的结构功能特性
据已知的VHH蛋白结构分析，VHH蛋白与VH蛋白的三级结构大体相同，都由2组反向平行β-折叠片层形成类桶装结构(高度为4～5 nm，直径为2～3 nm)。与抗原结合的3 个CDR 区间位于同一侧，靠近氮端。
但两者表面静电分布却有明显差别，VH 表面极性残基比较集中(如CDR3 区)，相对应的VHH 表面静电图显示亲水性残基较分散，由此可以阐明单独表达VH 结构域时蛋白易聚合形成包涵体，而VHH 的溶解度高、稳定性好的原因。
VHH 作为最小抗原结合单位，其分子质量约为常规抗体的1/10，结构简单，因此具备较好的组织穿透能力以到达肿瘤病灶，而过多的VHH 能较快由肾脏清除体外，对人体的免疫原性较弱。
相较于传统抗体，VHH 高变区间结构更为灵活、构型更多，可识别抗原的不同构型及不同表位，具有更广泛的抗原结合方式。

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纳米抗体来源及纳米抗体库构建
单链抗体最先在骆驼科动物体内发现，主要由免疫单峰驼和羊驼等骆驼科动物获得。

驼类血清中IgG 的总量约为5～10 g/L，其中IgG1 为传统抗体，IgG2 和IgG3 为单链抗体。

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VHH的制备--可以从血浆中提取
① IgG1和IgG3 通过亲和吸附蛋白G 亲和色谱柱(IgG2不与蛋白G结合)，而后用150mmol/LNaCl，0.58%醋酸(pH 4.5)的缓冲液洗脱分离出IgG3。
② 上一步穿过液再次通过蛋白G 亲和色谱柱以确保吸附其中剩余的少量IgG1 和IgG3，收集仅含IgG2 的流出液。采用蛋白A亲和色谱柱分离纯化。
③ 纯化后的IgG2 和IgG3 通过蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、金黄色葡萄球菌V8 蛋白酶等)酶解其VHH 和CH2 之间的铰链。
④ 用蛋白A凝胶过滤亲和色谱吸附酶解所得的CH部分，而VHH 随着穿过液流出，达到分离纯化目的，即从血清中纯化得到VHH。

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VHH 重组及库的筛选
免疫建库法主要包括四步：
① 免疫骆驼、② 提取VHH 基因、③ 建立特异性纳米抗体库、④ 运用噬菌体展示技术对库进行筛选

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引物设计：
抽取20～30 ml外周血，获取效应B 细胞并从中提取总RNA，运用逆转录PCR 技术获取VHH的cDNA序列。
第一种方法：利用抗体不同的同型，如IgG1 与IgG2、IgG3 的铰链存在较大差异的特点，设计合适引物以扩增高纯度VHH 片段。
① van der Linden 等设计一套引物可扩增出所有种类骆驼的VHH 部分。
② Maass 等设计了仅针对羊驼的VHH 区间的引物。